Л.А. Лутова - Генетическая инженерия растений - свершения и надежды (статья), страница 2

3).Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждениярастения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы(например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляютС О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0БИОЛОГИЯпродукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA иChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геномбактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения. VirA является гистидиновой протеинкиназой,способной к аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG.Фосфорилированный VirG активирует транскрипциюостальных vir-генов.

Индукция vir-генов обратима, чтоочень важно для патогена: в случае, если хозяин – больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК неосуществляется.Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Одиниз них является двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности явля-LBТ-ДНКRBTi-плазмидаVirE2ЦитоплазмаагробактерииIIIPVirG + PVirGPVirAIPVirC1VirD2VirD1VirE2VirD2VirD1PPIVVirC1IIТ-цепьв комплексес VirE2 и VirD2VirBVir-областьОболочка клетки агробактерииVя-хозяинаСигнальные молекулыастенинка ррастительной клеткия стеанчтоКлеКлеткарастенияVIVirB?Т-ДНКЯдроРис.

3. Основные этапы агробактериальной трансформации: I – активация хеморецептора VirA продуктами гидролиза клеточной стенки растения; II –фосфорилирование VirG – активатора транскрипции vir-генов и экспрессия vir-генов; III – присоединение VirD2 с помощью VirD1 и VirC1 к Т-ДНК и внесение однонитевого разрыва в районе правой границы (RB), вырезание нити Т-ДНК в районе правой илевой (LB) границ; IV – связывание VirE2 с Т-цепью итранспорт всего комплекса Т-цепь + VirD2 + VirЕ2 кпоре; V – пора в клеточной стенке агробактерии,сформированная продуктами оперона VirВ; VI – интеграция Т-ДНК в хромосому растения. Размеры иформы молекул выбраны произвольно.

Кольцеваяхромосома бактерии с геном ChvE на рисунке необозначенаются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы, режущейточно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар основанийповтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезаниеТ-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспортаТ-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК избактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин [4].Внедрение Т-ДНК в растительный геном являетсямногоступенчатым процессом. Недавние результатыанализа нуклеотидных последовательностей в участкахрастительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК,показали, что есть гомология между растительнойДНК по обеим сторонам от места встраивания и наружными областями плазмидной ДНК агробактерий.

Вгеном растения могут встраиваться несколько копийТ-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения [4]. Т-ДНКтранскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия вклетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины – источник азота и углерода.ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНОИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРАТ-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введениячужеродных генов в клетки растений.

Во-первых, кругхозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, втом числе злаков. Во-вторых, интегрированная в составгенома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя,а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторнаяобласть гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироватьсявставленные в Т-ДНК чужеродные гены [2, 3].Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A.

tumefaciens,содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставитьдальнейшее естественному ходу событий. Необходимотолько уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНКплазмиды. Однако размеры целой Ti-плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемыхв работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть этутрудность, разработан следующий подход (рис. 4) [1].Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды спомощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клеткахбактерий – Escherichia coli. E.

сoli содержит плазмидуЛ У Т О В А Л . А . Г Е Н Е Т И Ч Е С К А Я И Н Ж Е Н Е Р И Я РА С Т Е Н И Й : С В Е Р Ш Е Н И Я И Н А Д Е Ж Д Ы13БИОЛОГИЯpBR322, которая способна к саморепликации, то естьразмножению, приводящему к увеличению числа еекопий. После того как в плазмиду pBR322 внедрилиучасток Ti-плазмиды, это рекомбинантная структураможет затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием.

Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК,размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затемс использованием рестриктаз и стандартных приемовработы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. Этот молекулярный гибрид, теTi-плазмидаpBR322+Т-ДНКТ-ДНКpBR322Ген растенияВстраивание гена растенияв несущественный участок Т-ДНКpBR322AgrobacteriaTiГомологичнаярекомбинацияс Ti-плазмидойДНК растенияTi-плазмидасо встроеннымгеномИнтеграция Т-ДНКс новым геном в геномрастенийРис. 4. Использование Ti-плазмиды в качестве вектора.

Сначала Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды рестриктазами и клонируют в pBR322 E. coli. Затем вклонированную ДНК встраивают чужеродный ген.Полученной гибридной плазмидой заражают агробактерии; Т-ДНК рекомбинирует с Т-ДНК гибриднойплазмиды с образованием плазмид, несущих гетерологичный ген. С помощью таких агробактерий получают трансгенные растения14перь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в неегеном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят вклетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичнымиучастками (гомологичная рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti-плазмидТ-ДНК со встроенным чужеродным геном включаетсяв Ti-плазмиду, замещая нормальную Т-ДНК. Такимобразом, мы получаем клетки A.

tumefaciens, несущиеTi-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном. Последний этап заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженернымиметодами агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированнуюТ-ДНК со встроенным чужеродным геном, то есть цельработы, состоявшая во введении данного гена в геномрастения, будет достигнута [1, 3]. Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно упростить, если использовать бинарные векторные системы,создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере дверазные модифицированные Ti-плазмиды.

Одна из нихдолжна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмидыназывают плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужнымвстроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и насоседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом virи другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенныйген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений [3].В целом идеальная векторная система на основеTi-плазмиды должна: 1) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции вядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительнымиполимеразами промотор), маркер, который необходимдля селекции трансформированных клеток; 2) не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляютдифференцировку растительных клеток.

Второй пунктдостигается с помощью транспозонного мутагенеза(транспозон – последовательность ДНК, способнаяперемещаться по геному). В результате введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, которые приводят к опухолеобразованию (iaaM, iaaH, ipt), что неотражается на механизме переноса Т-ДНК. Обычноиспользуют бактериальные транспозоны (Tn5, Tn7).При этом снимается блок с процессов регенерации.При модификации Ti-плазмиды необходимо предусмотреть также наличие уникальных сайтов рестрикции, вС О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0БИОЛОГИЯкоторые будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК.Такие уникальные сайты рестрикции создаются включением в искусственные Ti-конструкции последовательностей, которые содержат множественные сайтыразрезания для рестриктаз EcoR1, Hind III, BamH1 идр.