Л.А. Лутова - Генетическая инженерия растений - свершения и надежды (статья)

БИОЛОГИЯГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ:СВЕРШЕНИЯ И НАДЕЖДЫЛ. А. ЛУТОВАСанкт-Петербургский государственный университетВВЕДЕНИЕGENETIC ENGINEERING OF PLANTSL. A. LUTOVAA brief review on plant genetic engineering byusage of Ti-plasmids is presented. The molecular mechanism of foreign genes transfer to theplant genome as well as methods for obtainingand applied usage of the transgenic plants isoutlined. The expectations related to plantgenetic are becoming real and transgenicplants are already subjects of modern agriculture.© Лутова Л.А., 2000Дан краткий обзор работ по генетическойинженерии растений с использованием агробактериальных плазмид. Представленные данные иллюстрируют перенос чужеродных генов в геном растения, получениетрансгенных растений и их использование впрактике. Надежды, которые возлагали нагенетическую инженерию растений, становятся реальностью, и трансгенные растения уже используют в сельском хозяйстве.10www.issep.rssi.ruПоиски путей введения чужеродных генов в клеткивысших растений интенсивно ведутся во всем мире сначала 70-х годов.

Одним из импульсов к развитию методов переноса чужеродных генов в растения стали результаты детального изучения молекулярно-генетических основ опухолевого роста у растений при участиибактерий рода Agrobacterium. В результате этих исследований оказалось, что опухолеобразующие плазмидыагробактерий (Ti – tumor inducing, индуцирующая опухоль), представляющие собой мини-кольцевые ДНК,являются природной векторной системой, которую сейчас используют для переноса генов в растения. Плазмида агробактерии переносит часть своей ДНК в ДНКрастительной клетки, в ДНК встраивается “нужный”ген.

С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений. Важно также то, что методы генной инженерии сейчас используют не только в практике, это важнейшая методологиядля познания фундаментальных основ организации ифункционирования растительного генома.ЧТО ТАКОЕ ГЕНЕТИЧЕСКАЯИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙГенетическая инженерия – это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК.Суть генетической инженерии сводится к переносу врастения чужеродных генов, которые могут сообщатьрастениям полезные свойства [1, 4, 6].

Такие манипуляции осуществляются с помощью соответствующихферментов – рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющих молекулы ДНК в строго определенных участках,и лигаз, сшивающих фрагменты в единую рекомбинантную молекулу ДНК.Итак, процедуры генетической инженерии сводятся к тому, что из набора фрагментов ДНК, содержащихнужный ген, собирают гибридную структуру, которуюС О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0БИОЛОГИЯзатем вводят в клетку. Введенная генетическая информация экспрессируется, что приводит к синтезу новогопродукта.

Таким образом, вводя в клетку новую генетическую информацию в виде гибридных молекул ДНК,можно получить измененный организм.Растения имеют одно очень важное преимуществоперед животными, а именно возможна их регенерацияin vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных (способных завязывать семена) растений (рис. 1).

Это свойство(тотипотентность) открывает для молекулярных биологов большие возможности в изучении функционирования генов, введенных в растения, а также используетсяв селекции растений. Для конструирования растенийнеобходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, разработать методы, обеспечивающиевключение его в наследственный аппарат растительнойклетки, регенерировать из единичных клеток нормальное растение с измененным генотипом. Таким образом,методология генетической инженерии в отношениирастений направлена на коренное изменение методовтрадиционной селекции, с тем чтобы желаемые признаки растений можно было получать путем прямоговведения в них соответствующих генов вместо длительной работы по скрещиваниям.Формальной датой рождения генетической инженерии растений является полученное с помощью Ti-плазмидного вектора первое в мире химерное растение санбин (sunbeen) как результат переноса гена запасногобелка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника(sunflower + been).

Это было первым ощутимым, хотя,быть может, и несовершенным свидетельством того,что в отношении растений генетическая инженериясможет оправдать надежды специалистов в области молекулярной генетики, биологии и селекции.абвКОРОНЧАТЫЕ ГАЛЛЫ РАСТЕНИЙВ группе почвенных бактерий, известных под общимназванием Agrobacteria, есть несколько видов, которыемогут заражать растения и вызывать образование опухолей, называемых корончатыми галлами, состоящими из недифференцированной опухолевой ткани, растущей в месте заражения.

Клетки корончатых галлов вомногих отношениях напоминают раковые клетки животных. Они приобретают способность к неограниченному, нерегулируемому росту. Когда клетки корончатыхгаллов культивируют in vitro, они растут при отсутствииспециальных гормонов, которые необходимы при культивировании нормальных растительных клеток. Болеетого, клетки корончатых галлов продолжают сохранятьэти свойства (трансформированный фенотип), дажеесли убить бактерии антибиотиками. Изучение индук-Рис. 1.

Иллюстрация уникального свойства растительной клетки – тотипотентности: а – каллус (массанедифференцированных клеток) табака, полученный из единичных клеток; б – органогенный каллус,полученный из каллуса табака при его перенесениина среду с цитокинином; в – регенерация растенийтабака из органогенного каллусатора опухолей Agrobacterium tumefaciens показало, чтособственно опухолеродным агентом у этой бактерииявляется Ti-плазмида, которая частично интегрируетсяв хромосомы растений (рис. 2).Л У Т О В А Л . А . Г Е Н Е Т И Ч Е С К А Я И Н Ж Е Н Е Р И Я РА С Т Е Н И Й : С В Е Р Ш Е Н И Я И Н А Д Е Ж Д Ы11БИОЛОГИЯАГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯРАСТЕНИЙ: Ti-ПЛАЗМИДЫВ A. tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плазмида. Плазмида содержит Т-ДНК (transferred DNA),которая составляет 12–22 тыс.

пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодируетферменты синтеза фитогормонов и опинов – производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии.Кроме Т-ДНК в Ti-плазмиде содержатся vir-область, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение, геныутилизации опинов, а также локусы, контролирующиеразмножение плазмиды в бактериальной клетке и ееперенос при бактериальной конъюгации (см. рис. 2)[2].

Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а нехромосомные гены бактерий ответственны за поддержание трансформированного состояния клеток корончатых галлов, были получены при изучении штаммовAgrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды.Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируютв зараженном растении ни образования корончатыхгаллов, ни синтеза опинов. Все полученные мутацииTi-плазмид разделяют на три основных класса. Мутанты первого класса не индуцируют синтез опинов, новызывают образование корончатых галлов. Мутантывторого класса утрачивают способность индуцироватьразвитие опухолей. Мутанты третьего класса стимулируют аномальную дифференцировку нормальных клеток, например избыточный рост корней или побегов.Эти генетические исследования показали, что ДНКAgrobacteriumТ-ДНКviroriОпухоль(корончатый галл)traTi-плазмидаИнтегрированнаяТ-ДНКРис.

2. Agrobacterium tumefaciens вызывает образование корончатых галлов (опухолей). Опухолеобразующим агентом является Ti-плазмида, содержащая область Т-ДНК (трансформирующая ДНК), которая интегрируется в растительный геном; virобласть, включающую гены, продукты которыхобеспечивают вырезание и перенос Т-ДНК в растительную клетку; tra-область, где локализованы гены,контролирующие конъюгацию бактерий, и ori-область, содержащую гены, продукты которых обеспечивают репликацию Ti-плазмиды12Ti-плазмид содержит гены, которые контролируютразвитие опухолей, синтез опинов [1–4]. Поскольку урастений с мутантными Ti-плазмидами второго и третьего классов с помощью фитогормонов можно стимулировать опухолеобразование, было предположено, чтополученные мутации затрагивают гормональный метаболизм [2, 4, 5].КАКИЕ ГЕНЫ ЛОКАЛИЗОВАНЫ В Т-ДНКВ области Т-ДНК картировано не менее шести генов,отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов.

Ген iaaM 1 кодирует фермент триптофан-2монооксигеназу, которая переводит триптофан в индолилацетамид. Ген iaaH 2 кодирует гидролазу, превращающую индолилацетамид в гормон растений ауксин –индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная деятельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образованияприродного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Изопентенилтрансфераза, кодируемая геном ipt, катализируетранние стадии биосинтеза природного цитокинина. Гены iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, таккак продуктами этих генов являются фитогормоныауксин и цитокинин, которые индуцируют делениеклеток [1, 2, 4, 5]. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лактата, который является продуктом превращения ауксина.

Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект.Ген tml 6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6анеобходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6бизменяет чувствительность растительных тканей к цитокинину и сохраняет клетки в недифференцированном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток ипереводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов.МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕМЕХАНИЗМЫ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙТРАНСФОРМАЦИИПроцесс трансформации можно разделить на четыреэтапа: прикрепление бактерии к стенке растительнойклетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессияТ-ДНК (рис.