И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика, страница 100

Работая с хромосоъшми личинок сциарид. Д. Полсон и с!. Метц нашли, что гигантские вздутия, характерные для зтог о вида, формируются из дисков, а затем вздутия вновь превращаготся в диски. Детальные исследования В. Беермана, К. Павана, М. Бройер и с!г. Мехельке в начале Электронно-микроскопическая фотография 'гкднзон-нпдупирусмого пуфа 63Е н пуфа теплового шока 63 В в третьей хромосоме дрозофнлы. Район хромосомы 63А-С до гбг н цосяс гс) кондовогоо шока, до 00 и нослс га) индукции гкггизоггокг.

Фотографнн любезно прсдоставггсггы В. Ф. Ссмсшнным 50-х гт. привели авторов к заключенинг о том, что пуфы н кольца Бальбиани являются районами хромосом, в которых гены находятся в активном состоянии, т. е. разрыхление материала диска и формирование нз него специфического пуфа есть морфологическое проявлегггие активнрования гена, коррелирующсе с определенным состоянием дифференцировки. Разрыхление материала диска связано с тем, по в области активнруемого гена происходит накопление сначала различных белков, входящих в транскрипционные комплексы, а затем вновь синтезируемой РИК и белкггв. упаковывагощих зту РНК в специфические гранулы, в составе которых опа транспортируется из ядра в цитоплазму Пуфы — зто участки хромосом, наиоолее акзивные в транскрипции.

Око- ЗЗ1 Глава 73. ПОЛ31ТГЗ1НЫГ ХРОМОСОМЫ пуф 42Л (еьй) 30 40 50 В1 В2 60 70 80 тпн У.п 0 10 20 Л ° ПИ ° Ес)! Л ° Гс)1 В! ° Бей В2 пуф 2С (пзр) 0 Хп пуф 7ЯС (Г73) О Х„10 20 ЗО тпп я и- Л ° з! В 11 2 тпн уф 39с ((энпз9) 0 2 4тпи в- ~ИИ иуф 75СО (ГТХ-Г !) и 3 3 Хп ! 1 П пуф 46Г (13нйЗ) 3 10 15 тпн Хп ! ИИП! ИИ Молекулярная организация генов, локализованных в некоторых пуфах дрозофилы (Нпе! е! а1., 1995.

— Из: ХЬ!гпп!еч, 1999. Р. 321). Цифрами вверху обозначена протяженность участка ДНК, занимаемого геном, прямоугольниками показаны зкзоны, соадииякяцие их зигзагообразные линии -- иитроиы. Несколько рядов зкзоиов-иитроиов представляют различные изоформы беяков, траислируемые е генов в результате альтернативно~о снлайсинга Литература к разделу 73.8 ло 50 % включения 'Н-уридина в клетках слюнных желез приходится на пуфы. В 1961 г. В. Беерман нашел корреляцию между появлением гранул секреции в клетках особой доли слюнной железы Оз. рад(г7Гт!тгиз и активностью дополнительного кольца Бальбиани в клетках этой доли. Таким образом впервые была обнаружена связь между активностью пуфа и продуктом, синтезируемым клеткой. За последние 1О лет выделена и клонирована ДНК примерно двух десятков пуфов.

Эта ДНК, как оказалось, содержит гены, имеющие очень большую протяженность — 50 — 120 тпн. В составе генов --- многочисленные экзоны, вступающие в альтернативный сплайсинг, и очень длинные (до 40 тпн) интроны (рис.! 3.13). Жимудев И. Ф. Хромочерная организация политеиных хромосом. Новосибирск: Наука, 1994. 564 с. Хйппв!ет 1. Е Оепебс огяап!га!!оп о(ро!у!епе сйгопзозошез Л Абтапсез (п Оепебсз. !999. 3Го1.

39. Р. 1 — 599. ззг ОБ1ЦЛЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА 13.9. ГОРМОНАЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ ПУФОВ ббВ 71С вЂ” Е 74ЕЕ 75В 75С(3 б 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 б 7 8 9 1О 11 12 13 3-й личиночный возраст Нрелкукол ка Куколка Сталин развития, ч Изменения активности пуфов 3).-хромосомы лрозофнлы в онтогенезе (Вес1сек 1962. — Из: Укнуулв, 1994. С. 209) У многих видов отряда Вбрзега, у которых личиночное развитие проходит быстро (за несколько дней), картины пуфов сменяют друг друга очень быстро, и эти изменения легко наблюдаются.

У наиболее изученного вида— дрозофилы - — детально описано пуфирование всех хромосом на протяжении последних 24 ч личиночного развития и 12 ч — предкуколочного. Все пуфы можно разделить на два типа: крупные, или собственно вздутия, и малые, в которых увеличения диаметра хромосомы нет, однако диски данного района уже разрыхлены, деконденсированы, т. е. транскрипционно активны. Каждая стадия развития личинки или пред- куколки характеризуется определенным набором (паттерном) крупных пуфов. В ходе развития эти наборы закономерно изменяются (рис. 13.14). У наиболее молодых личинок, у которых политенные хромосомы уже достаточно крупные и доступны для анализа, присутствуют только так называемые межлинечные пуфы (68С на рис. 13.14).

В самом конце личиночного развития, примерно за 6 ч до формирования предкуколки (пупариума), на фоне резкого повышения титра гормона экдизона эти пуфы инактивируются и начинают формироваться другие пуфы, сначала ранние, т. е, раньше других (примерно через 30 мин) среагировавшие на поступление гормона (74ЕЕ и 75В). затем поздние — реагирующие с задержкой на несколько часов (78(3, 66В, 71С-Е).

У предкуколок в момент формирования пупариума (О ч) активность пуфов наивысшая, в том смысле что именно на этой стадии развития наибольшее число пуфов в геноме активно и размеры многих пуфов максимальны. После достижения пика в последующие 2-3 ч происходит быстрый спад активности пуфов, когда в хромосомах присутствуют единичные пуфы. В конце стадии предкуколки (опять на фоне повышенного титра экдизона) возникает повторная волна активности ранних и поздних пуфов. Эти волны находятся под контролем стероидного гормона экдизона, регулирующего развитие насекомых. В результате исследования взаимоотношений экдизона и пуфов были открыты наиболее основополагающие механизмы действия стероидных гормонов в целом, причем задолго до того, как появились высокораз- Гинл !3.

ПОЛИТВНПЫВ ХРОМОСОМЫ 333 ° д !,0 е. 1,8 ° ° !,0 0 Майкл Эшбернер (р. !942? решающие методы молекулярно-генетического анализа. В 1959 г. Х. Беккер (Н. Вес1сег) установил, что мутация гена !(2)л1, экспрессирующегося в кольцевой железе, вырабатывающей экдизон, останавливает формирование пуфов. В 1960 г. У. Клевер и Н. Карлсон ((!. С!егег, Р. Каг1зоп), инкубируя слюнные железы !л Р!гго в растворе с гормоном, индуцировали пуфы, которые появляются в нормальном развитии на фоне высокой концентрации экдизона.

Таким образом впервые установили, что гормоны осуществляют свое действие, активируя гены. В 1964 г. У. Клевер обнаружил, что экдизон вызывает целый каскад взаимосвязанных изменений, в которых гены, активируемые гормоном раньше„влияют на индукцию генов, более поздно реагирующих на гормон. Наиболее фундаментальные исследования процесса активирования генов (пуфов) под действием гормона экдизона провел английский генетик М.

Эшбернер (М. АзЬЬпгпег) (рис. ! 3.15). Исследования гормональной регуляции активности генов удобнее проводить не на живом организме, а в системе гп Р(гго, т. е. инкубируя органы в пробирке„благодаря чему можно по усмотрению экспериментатора изменять условия обработки гормонами --- варьировать их концентрации, продолжительность воздейст- Л к !2 Время после обработки, ч Развитие позднего пуфа 82Р (и) и раннего пуфа 75В (б) пол воздействием экдизона (!) или экднзона с ингибнтором синтеза белка циклогексимидом (2) (АзЬЬиглег, к(сЬагоя, !976.— Из: Жимулев, !994. С, 264) вия, использовать вещества, прерывающие протекание различных процессов (ингибиторы). В результате серии остроумных экспериментов М. Эшбернер показал, что ранние и поздние пуфы различаются по многим признакам. Во-первых, это реакция на ингибиторы синтеза РНК и белков.

Если через час после начала инкубации клеток слюнных желез с ингибитором синтеза белков — циклогексимидом добавить гормон экдизон, ранние пуфы все же образуются, т. е. для их индукции не требуется предварительного синтеза белков. Они используют те белки, которые были синтезированы задолго до этого. В поведении ранних пуфов обнаружилась еще одна удивительная особенность. Обычно они быстро реагируют на гормон — активируются, через четыре часа развиваются до максимальных размеров, затем полностью инактивируются, и материал пуфа, компактизуясь.

превращается в диск. В присутствии ингибитора синтеза белка ранние пуфы нормально активируются, но их обычная инактивация не происходит (рис. 13.16, б). Этот факт может свидетельствовать только об одном: инактивация ранних пуфов — - такой же ОБРДАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНГТИКА и' .

2,2 ц 4. Й 1,4 о 3 Время после обрабогки, ч Влияние удаления экднзона из инкубационной среды на размер раннего пуфа 74ЕЕ !АзЬЬшпег. К!сЬагоз, 197Г>. — Из: Жимулев, 1994. С. 267). Сллсшная линия — — изменение размера пуфа я среде с гормонам, штриховая — лри отмывке эядизона гормонально-индуцируемый процесс, как и их индукция. Отсюда вытекает другой важный вывод: белки, выключающие активность ранних пуфов, кодируются в самих ранних пуфах. Поздние пуфы на фоне ингибирования синтеза белка не индуцируются (рис. 13.16, а).

Это означает, что для их индукции необходимы белки, синтезируемые под действием гормона экдизона, т. е. в ранних пуфах. Во-вторых, как оказалось, ранние и поздние пуфы еще более различаются по реакции на удаление гормона из клеток. Если некоторое время инкубировать железы в пробирке в растворе, содержащем гормон, а затем поместить в новый раствор, но уже без гормона, ранние пуфы быстро уменьшаются в размерах и исчезают совсем (рис. 13.! 7). На индукцию поздних пуфов отмывка гормона влияет очень специфично. Если удалять гормон через 1, 2, 3 ч от начала инкубации, то ничего не происходит. Если инкубация уже протекала 4 и более часа, то удаление гормона приводит к быстрой преждевременной индукции поздних пуфов (рис.