В.М. Глазер - Генетическая рекомбинация без гомологии - процессы, ведущие к перестройкам в геноме (статья), страница 3

5). Процесс происходит в несколько этапов. Сначала транспозаза (у ретротранспозонов ее называют интегразой) сводит вместе концы подвижного элемента и делает разрывы точно поэтим концам, либо в обеих цепях, как в случае нерепликативной транспозиции, либо в одной из цепей,как при репликативной транспозиции и при интеграции ДНК ретротранспозонов (рис. 5, а). Затемтранспозаза сводит в контакт концы элемента и дуплекс ДНК-мишени. При этом она делает в обеих цепях ДНК-мишени ступенчатые разрывы (рис. 5, б ),отстоящие друг от друга на столько п.н., сколько ихобнаруживается в прямом повторе ДНК-мишени уданного элемента.

Следующий этап – обмен цепями, приводящий к рекомбинации между ДНК элемента и мишени. 3'-OH-концы элемента соединяются с 5'-P-концами мишени, оставляя за счетступенчатости разрывов бреши между 5'-P-концами элемента и 3'-OH-концами мишени (рис. 5, в).Катализируемое транспозазой расщепление и замыкание концов цепей ДНК происходят без потериëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998а5'5'5'3'б3'3'3'5'3'5'тивная транспозиция (рис. 6, а) отличается тем, чтоподвижный элемент, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Это может произойти только за счет удвоения (репликации) элемента.

При этом кольцевые ДНК донора имишени сливаются, образуя коинтеграт, в которомпоследовательности обеих молекул разделены двумя копиями элемента, расположенными в однойориентации. Вслед за этим происходит разрешениекоинтеграта на исходные молекулы, каждая из которых содержит копию элемента. Последняя реакцияосуществляется по механизму сайт-специфическойрекомбинации ферментом резолвазой, котораяа5'3'в3'5'5'3'+бв+Обратнаятранскрипцияг5'3'+ЦитоплазмадЯдро5'3'Рис.

5. Общая схема рекомбинационных реакцийпри транспозициях. Линии соответствуют цепямДНК. Красные линии изображают подвижный элемент, черные линии – ДНК, окружающую подвижный элемент в сайте его первоначальной локализации, зеленые линии – ДНК-мишень. Сплошныестрелки на рис. 5, а указывают сайты обязательных разрывов цепей ДНК на концах подвижногоэлемента, пунктирные стрелки – сайты необязательных разрывов. Пунктир на рис.

5, г изображает репаративную репликацию в брешах ДНК-мишени, что приводит к образованию прямых повторов из нуклеотидов ДНК-мишени по бокамвстроенного элемента. На рис. 5, д эти повторывыделены жирными линиями. Остальные пояснения даны в текстеэнергии фосфодиэфирной связи и не требуют АТФ,что напоминает консервативную сайт-специфическую рекомбинацию. Но сказанное не относится кбрешам, которые на следующем этапе заполняютсяпутем репаративной репликации ДНК по матрицеДНК-мишени (рис. 5, г). Репаративная репликацияи легирование оставшегося после нее одноцепочечного разрыва требуют дополнительных затрат энергии.

Обратим внимание на то, что заполнение брешей является причиной возникновения описанныхвыше прямых повторов ДНК-мишени на концахэлемента (рис. 5, д). Таким образом, мы разобралиобщую основу транспозиционной рекомбинации.Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозиций изображены на рис. 6. Реплика-+ИнтеграцияТранскрипция+Рис. 6. Основные механизмы транспозиций. а –Схема репликативной транспозиции. Окружностиизображают кольцевую двуцепочечную ДНК. Подвижный элемент представлен в виде красногопрямоугольника, красная стрелка указывает ориентацию элемента. Черная окружность – ДНК сдонорным элементом, зеленая окружность – ДНКмишень.

Знак Х показывает сайт-специфическийобмен между рекомбинационными сайтами подвижных элементов, осуществляемый резолвазой; б – схема нерепликативной транспозиции.Условные обозначения те же, что на а; в – упрощенная схема цикла транспозиции у ретротранспозонов. Синяя линия изображает РНК-копию ретротранспозона с короткими прямыми концевымиповторами, представленными в виде прямоугольников. Красная линия – двуцепочечная ДНК-копияретротранспозона, но с длинными прямыми концевыми повторами (красные прямоугольники).Зеленая линия – ДНК-мишень (хромосома клеткихозяйского организма). Зеленые прямоугольники, примыкающие к ретротранспозону, – прямыеповторы ДНК-мишени из 5 п.н. Масштаб не соблюден.

Остальные пояснения даны в текстеÉãÄáÖê Ç.å. ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü ÅÖá ÉéåéãéÉàà: èêéñÖëëõ, ÇÖÑìôàÖ ä èÖêÖëíêéâäÄå Ç ÉÖçéåÖ27входит в ту же группу сайт-специфических топоизомераз, что и инвертазы. Но резолваза отличаетсятем, что использует имеющиеся внутри элементоврекомбинационные сайты, если они находятся водинаковой ориентации.

В предыдущей статье ужеговорилось о том, что гомологичная рекомбинациямежду повторами ДНК, расположенными в однойориентации, приводит к делеции материала, заключенного между повторами. Так и здесь сайт-специфическая рекомбинация между двумя прямыми повторами подвижного элемента приводит как бы кделеции из коинтеграта одной из плазмид, составляющих коинтеграт, вместе с одной копией подвижного элемента. Это и есть разрешение коинтеграта.Репликативная транспозиция – относительно редкий механизм.

Он обнаружен у фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с короткимиобращенными повторами.Впервые механизм одной из реакций незаконной рекомбинации был описан японским исследователем Х. Икедой с сотрудниками в 1982 году. Вопыте in vitro эти авторы продемонстрировали рекомбинацию между полностью негомологичнымиДНК плазмиды pBR322 и фага лямбда, катализируемую высокоочищенной топоизомеразой II (ДНКгиразой) E.

coli. Согласно модели, предложеннойавторами, две молекулы гиразы, каждая из которыхсостоит из двух пар субъединиц, временно разрывают в обеих молекулах обе цепи ДНК, удерживая ихконцы. Затем они обмениваются парами субъединиц вместе с удерживаемыми концами разныхДНК-партнеров и сшивают концы дуплексов. Позднее Икеда показал такую рекомбинацию и in vivoв клетках E. coli. К настоящему времени накопленыданные об участии топоизомераз обоих типов в незаконной рекомбинации у бактерий и эукариот.Неконсервативная транспозиция (рис. 6, б) заключается в вырезании элемента и его перемещении в новое место.

Этот механизм характерен длябольшинства подвижных элементов бактерий и эукариотических элементов с короткими обращенными повторами. Как уже указывалось, у ретротранспозонов с длинными концевыми повторамитранспозиция происходит по схеме, включающейРНК-интермедиат. В этом процессе участвуют специальные ферменты, кодируемые самими ретротранспозонами (см.

рис. 4, в). В их центральной части расположен ген pol, кодирующий нескольконеобходимых для транспозиции ферментов: интегразу, обратную транскриптазу и РНКазу H, которыепервоначально образуются в виде общего белка, апотом нарезаются на отдельные белки под действием специальной протеазы, также кодируемой геномpol.

Схема транспозиции дана на рис. 6, в. С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия,но уже с короткими концевыми прямыми повторами, с нее путем обратной транскрипции синтезируется ДНК-копия с длинными повторами, котораявстраивается в новое место с помощью интегразы.Рекомбинация у ретроэлементов без концевых повторов менее изучена, но она также осуществляетсячерез РНК-интермедиат.В последнее десятилетие у амфибий и млекопитающих обнаружены ферменты, связывающие двуцепочечные концы ДНК независимо от их гомологии. Природа этих белков до последнего времениоставалась неясной.

Сенсационный прорыв в данной области возник в 1994–1995 годах в результатеисследования мутантов грызунов, проявляющихповышенную по сравнению с нормальными особями чувствительность к ионизирующим излучениям.Известно, что ионизирующие излучения вызываютдвуцепочечные разрывы ДНК, то есть разрывы хромосом, для залечивания которых в нормальнойклетке существуют специальные системы репарации. У мутантов они нарушены. Кроме того, у мутантов оказалась подавленной и интеграция в хромосомы фрагментов ДНК, искусственно введенныхв клетки.

Это неудивительно, поскольку у млекопитающих в основе процессов как интеграции чужеродной ДНК, так и репарации двуцепочечных разрывов лежит соединение концов разорванныхдвуцепочечных ДНК, обходящееся без гомологии,то есть оба процесса осуществляются по механизмунезаконной рекомбинации (в отличие от дрожжей ибактерий, у которых они основаны на гомологичной рекомбинации). Неожиданным оказался тотфакт, что мутанты проявили неспособность к рекомбинационным перестройкам в кодирующих иммуноглобулины последовательностях ДНК, а этоозначает, что незаконная рекомбинация играетважную роль и в этих перестройках.

Таким образом,было выяснено, что в рекомбинации иммуноглобулиновых последовательностей ДНК задействованыдва разных механизма. Ранние этапы – образованиесайт-специфических двуцепочечных разрывов происходят по типу сайт-специфической, а поздние –воссоединение концов разрывов – по механизмунезаконной рекомбинации. Выявлен и фермент, ответственный за такую незаконную рекомбинацию:указанные выше радиочувствительные мутантыоказались дефектными по ДНК-зависимой протеинкиназе.

Фермент активируется, связываясь соçÖáÄäéççÄü êÖäéåÅàçÄñàüНезаконная рекомбинация – это сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК, и при этом безучастия механизмов сайт-специфической рекомбинации или транспозиций. В качестве примеровможно привести захват ретровирусом некоторыхклеточных генов при его эксцизии из хромосомыхозяйской клетки, а также интеграцию фрагментовДНК, вводимых в клетки позвоночных с помощьюмикроинъекций.