В.М. Глазер - Генетическая рекомбинация без гомологии - процессы, ведущие к перестройкам в геноме (статья)

GENETICRECOMBINATIONWITHOUT HOMOLOGY:PROCESSES CREATINGGENOMEREARRANGEMENTSV. M. GLASERThe article presents threetypes of genetic recombination are considered:site-specific recombination, illegitimate recombination and transposition.These types of recombination differ from each otherby mechanisms of recombinational reactions andenzymes catalyzing thesereactions. Their fundamental difference fromhomologous recombination is the absence ofhomology between recombining DNA molecules.ГЕНЕТИЧЕСКАЯРЕКОМБИНАЦИЯБЕЗ ГОМОЛОГИИ: ПРОЦЕССЫ,ВЕДУЩИЕ К ПЕРЕСТРОЙКАМВ ГЕНОМЕÇ. å.

ÉãÄáÖêåÓÒÍÓ‚ÒÍËÈ „ÓÒÛ‰‡ÒÚ‚ÂÌÌ˚È ÛÌË‚ÂÒËÚÂÚËÏ. å.Ç. ãÓÏÓÌÓÒÓ‚‡Предыдущая статья была посвящена механизмам генетической рекомбинации, совершающейсяна основе гомологии между рекомбинирующимиДНК. Здесь будут рассмотрены процессы рекомбинации, либо использующие очень ограниченнуюгомологию между рекомбинирующими ДНК, либовообще обходящиеся без нее.

Они внесли существенный вклад в эволюцию генетического материала, но наиболее ярко их биологическое значениепроявляется в онтогенетических перестройках геномов, играющих важную роль в жизнедеятельностивирусов, бактерий и эукариот. Эти рекомбинационные системы – сайт-специфическая рекомбинация,транспозиции и незаконная рекомбинация – в корне отличаются от гомологичной рекомбинации помеханизмам и наборам контролирующих их генов.© É·ÁÂ Ç.å., 1998ëÄâí-ëèÖñàîàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü22ê‡ÒÒÏÓÚÂÌ˚ ÚË ÚËÔ‡ „ÂÌÂÚ˘ÂÒÍÓÈ ÂÍÓÏ·Ë̇ˆËË: Ò‡ÈÚ-ÒÔˆËÙ˘ÂÒ͇flÂÍÓÏ·Ë̇ˆËfl, Ú‡ÌÒÔÓÁˈËË Ë ÌÂÁ‡ÍÓÌ̇fl ÂÍÓÏ·Ë̇ˆËfl.

ä‡Ê‰˚È ËÁÔÂ˜ËÒÎÂÌÌ˚ı ÚËÔÓ‚ ÂÍÓÏ·Ë̇ˆËË ÓÚ΢‡ÂÚÒflÓÚ ‰Û„Ó„Ó ÔÓ ÏÂı‡ÌËÁÏ‡Ï ÂÍÓÏ·Ë̇ˆËÓÌÌ˚ı‡͈ËÈ Ë Ì‡·Ó‡Ï ͇ڇÎËÁËÛ˛˘Ëı Ëı ÙÂÏÂÌÚÓ‚. àı Ó·˘Â ÓÚ΢ˠÓÚ„ÓÏÓÎӄ˘ÌÓÈ ÂÍÓÏ·Ë̇ˆËË ÔÓfl‚ÎflÂÚÒfl ÔËÓÚÒÛÚÒÚ‚ËË „ÓÏÓÎÓ„ËËÏÂÊ‰Û ÂÍÓÏ·ËÌËÛ˛˘ËÏË ÏÓÎÂÍÛ·ÏË Ñçä.Сайт-специфическая рекомбинация происходит между специфическими последовательностямиДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15–30 п.н. Она широко распространена у прокариот и низших эукариот. Сайт-специфическая рекомбинация обеспечивает интеграцию(включение) ДНК умеренных фагов в хромосомыбактерий, инверсию (изменение ориентации) отдельных участков ДНК в хромосомах бактерий ибактериофагов и в так называемой 2-микроннойплазмиде дрожжей, а также другие процессы, играющие важную роль в циклах развития фагов ибактерий.

Редкий, если не единственный, но затожизненно важный пример сайт-специфическойрекомбинации у многоклеточных животных – перестройки в последовательностях ДНК, кодирующих иммуноглобулины, – белковые молекулы, распознающие тот или иной антиген при иммунномответе у позвоночных.Рассмотрим некоторые из самых известных примеров сайт-специфической рекомбинации.

Наиболее изучена она у умеренного бактериофага лямбда.После инфекции в клетку E. coli линейная вирионная двуцепочечная ДНК фага (рис. 1, а) замыкаетсяëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998AаattPJ POP' Nс attP ограничена центральной частью из 15 п.н., вкоторой имеются два сайта связывания с интегразой. Интеграза является топоизомеразой типа I1, нотолько сайт-специфической. В результате образования комплекса интегразы с attP-сайтом и белкомIHF формируется сложно уложенная нуклеопротеидная структура, которая захватывает сайт attB. Вэтой структуре последовательности ДНК att-сайтовсвязываются за счет взаимодействий между субъединицами интегразы и затем подвергаются согласованному расщеплению.RPOP'galбbioBOB'attBИнтеграцияOP'lB NgaattLЭксцизияR AJ POBb'ioattRвгРеакция в общем виде:Int, IHFBOP' + POB'Int, IHF, XisPOP' + BOB'Рис.

1. Схема сайт-специфической рекомбинации у фага лямбда. Линии соответствуют цепямДНК, две параллельные линии – дуплексу. Синимцветом изображена ДНК фага, красным – частькольцевой хромосомы E. coli. P, P' и B, B' – последовательности сайтов attP и attB соответственно,окружающие центральную часть (О). A, J, N и R –гены фага. Полустрелки, идущие вниз, указываютнаправление процесса интеграции фага; полустрелки, идущие вверх, – направление вырезания(эксцизии) профага. а – линейная (вирионная)ДНК фага; б – ДНК фага после инфекции в клеткуE. coli замыкается в кольцо, и находящийся в нейсайт attP вступает в рекомбинацию с сайтом attB вхромосоме бактерии.

Кроссинговер показан знаком Х; в – продукт рекомбинации – профаг в составе хромосомы бактерии; г – запись процессарекомбинации в общем виде. Остальные пояснения даны в текстев кольцо (рис. 1, б ) за счет имеющихся на ее концахкомплементарных одноцепочечных последовательностей. Последующее развитие фага может идти попути интеграции в хромосому бактерии между генами gal и bio (рис. 1, в). Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромосомебактерии. Интегрированный фаг называется профагом.

Он фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы происходит в обратнойпоследовательности событий. Запись реакций вобобщенном виде представлена на рис. 1, г. Из неевидно, что в интегративной рекомбинации участвуют сайты attP и attB, продукт фагового гена int (интеграза) и белок IHF (Integration Host Factor) E. coli.Для эксцизии необходимы сайты attL и attR, те жебелки и еще продукт фагового гена xis.

Сайты attP иattB неравноценны. Первый устроен сложно. Приразмере около 270 п.н. он состоит из центральнойчасти О и двух примыкающих к ней частей: P и P'.Внутри сайта attP располагаются участки связывания с интегразой и белками IHF и Xis. Сайт attBустроен проще. Его размер всего 23 п.н., гомологияКак и все топоизомеразы I, интеграза делает разрыв в одной цепи каждого дуплекса, и в месте разрыва образуются 3'-P и 5'-OH-концы ДНК. Ферментковалентно связывается с 3'-P-концом, благодарячему энергия разорванной фосфодиэфирной связисохраняется, и для последующего замыкания разрыва, осуществляемого тем же ферментом, не требуется дополнительной энергии.

Этим топоизомеразы отличаются от ДНК-лигаз, использующих длясшивания концов цепей ДНК энергию, освобождающуюся за счет гидролиза соединений типа АТФ.Поэтому разрыв полинуклеотидной цепи, образуемый топоизомеразой, называют “временным” в отличие от фиксированных одноцепочечных разрывов, производимых эндонуклеазами. При этоминтеграза может осуществлять рекомбинацию между att-сайтами путем замыкания фосфодиэфирнойсвязи с 5'-OH-концом из другого дуплекса, то естьпутем обменов 5'-OH-концами. Такая рекомбинация между дуплексами, не требующая дополнительной энергии, называется консервативной.На рис. 2 изображены только основные деталисложного молекулярного процесса интегративнойрекомбинации.

В упрощенном виде его можно представить следующим образом: сначала интегразапроизводит обмен между двумя цепями одинаковойполярности. При этом разрыв и воссоединение цепей происходят между строго определенными нуклеотидами в центральной части att-сайтов (рис. 2, а).В результате возникает структура, физически соответствующая полухиазме Холлидея (рис. 2, б). Затемна расстоянии 7 п.н. происходит вторая пара обменов между двумя другими цепями, не участвовавшими в первом обмене. Вторая пара обменов приводитк интеграции фага (рис. 2, в); интегрированный профаг фланкирован рекомбинантными сайтами attL иattR, как это уже было показано на рис. 1, в.

Предполагается, что для катализа этой реакции необходимы четыре субъединицы интегразы, связанные вatt-сайтах.Важно отметить, что все изученные ферменты,непосредственно осуществляющие сайт-специфическую рекомбинацию у фагов и бактерий, а также1О топоизомеразах см. статью: Фаворова О.О. СохранениеДНК в ряду поколений: репликация ДНК // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 4. С. 11–17.ÉãÄáÖê Ç.å. ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü ÅÖá ÉéåéãéÉàà: èêéñÖëëõ, ÇÖÑìôàÖ ä èÖêÖëíêéâäÄå Ç ÉÖçéåÖ23аGCT T T T T T A T A CT A ACGA A A A A A T A T GA T TбвРис. 2. Схема двух основных этапов интегративной рекомбинации у фага лямбда: а – нуклеотидная последовательность att-сайтов в центральнойчасти O.

Вертикальные черточки указывают сайтыразрывов, предшествующих обмену цепями между attP и attB; б – промежуточная структура, образовавшаяся после обмена между двумя цепямиДНК одинаковой полярности в att-сайтах. Физически она соответствует полухиазме Холлидея; в –продукт завершенной рекомбинации. Остальныепояснения даны в текстебелок, катализирующий инверсию в 2-микроннойплазмиде дрожжей, являются сайт-специфическими топоизомеразами I. По уровню гомологии ихаминокислотных последовательностей и механизмукатализирумых реакций их разделяют на две группы: представителями первой группы являются ужерассмотренная нами интеграза фага лямбда, интегразы других умеренных фагов и белок, катализирующий сайт-специфическую рекомбинацию в плазмиде дрожжей, ко второй относят инвертазы бактерийи фагов и некоторые другие ферменты сайт-специфической рекомбинации.Сайт-специфическая рекомбинация, катализируемая ферментами второй группы, происходит поболее простой схеме, чем в случае интеграз.

Рассмотрим ее на примере инвертазы фага Mu. В центральной части своей хромосомы фаг содержит особыйсегмент G размером около 3 т.п.н. Сегмент имеет наконцах инвертированные (обращенные) повторыдлиной около 30 п.н. В каждом повторе, в свою очередь, имеется специфический рекомбинационныйсайт. Инвертаза проводит рекомбинацию междуэтими сайтами (рис. 3, а). Четыре субъединицыфермента, по одной субъединице на каждую цепьДНК, делают “временные” разрывы в обеих цепяхкаждого рекомбинационного сайта, то есть одновременно расщепляют все четыре цепи, образуя 5'-Pи 3'-OH-концы. При этом разрывы цепей в каждомдуплексе происходят на расстоянии 2 п.н., так что3'-конец как бы выступает.

Фермент ковалентно24связывается с 5'-P-концами. Затем одна часть первого дуплекса меняется местами с такой же частьювторого дуплекса, после чего восстанавливаютсяфосфодиэфирные связи во всех четырех цепях.Приведенная реакция, как и большинство изпроцессов, осуществляемых инвертазами у бактерий кишечной группы и их фагов, входит в особуюсистему сайт-специфических инверсий ДНК, получившую название Din (от DNA inversions). Помимофага Mu сайт-специфические инверсии обнаружены у умеренного фага P1 и энтеробактерий E. coli,Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii.