В.М. Глазер - Генетическая рекомбинация без гомологии - процессы, ведущие к перестройкам в геноме (статья), страница 2

Инверсииспециальных сегментов хромосом, ограниченныхобращенными повторами ДНК длиной около 30 п.н.,происходят с высокой частотой путем рекомбинации в этих повторах. Меняя ориентацию определенных генов относительно их промоторов, инверсииприводят к включению одних генов и выключениюдругих. Это один из примеров регуляции работы генов путем специфических перестроек ДНК. Ониимеют приспособительное значение. Например, уS. typhimurium инверсии сегмента H переключаютгены H1 и H2, кодирующие разные типы белка флагеллина, из которого построены жгутики, что позволяет этой патогенной для мышей бактерии менятьповерхностный антиген и тем самым ускользать отдействия иммунной системы хозяина.

У фагов инверсии переключают гены, кодирующие разные белки хвостовых отростков, что приводит к смене хозяев – бактерий, в которых может размножаться фаг.В качестве конкретного примера вернемся к системе инверсий G-сегмента у фага Mu (рис. 3, б ).Сегмент содержит четыре гена: U, U ', Sv и Sv '. Двапоследних представлены в сегменте только своимивариабельными частями, тогда как их общая константная часть Sc вместе с промотором P примыкаетк сегменту слева. Справа от сегмента G расположенген инвертазы gin.

При одной ориентации сегмента(G+) транскрибируются гены Sv и U, при противоположной ориентации (G−) функционируют гены Sv'и U '. В первом случае фаг размножается на E. coli B,E. coli K12 и S. typhimurium, во втором – на E. coli C,Citrobacter freundii, Shigella sonnei и др. Следует особоотметить, что все работающие в системе Din инвертазы фагов и бактерий заменяют друг друга в рекомбинации in vitro. Это обусловлено их общим происхождением: инвертазы гомологичны между собойна 60–70% и их рекомбинационные сайты в обращенных повторах на концах инвертируемых сегментов также гомологичны.Завершая описание сайт-специфической рекомбинации отметим ее принципиальные отличияот гомологичной рекомбинации.

В случае последней молекулы ДНК узнают друг друга путем прямого сопоставления их последовательностей через посредство рекомбиназ типа белка RecA. Для этого вДНК вводятся специальные пресинаптическиеповреждения, высвобождающие одноцепочечныеëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 19985'а3'5'3'5'3'C T CGC G A GG A G CG C T C5'C TC GGAGC3'C TCGC TCAG C3'5'3'(G +)5'GG AG C5' CG3'TC GG AG CC T C GC G A GG A G CG C TC3'(G −)5'б(G +)PSc SvUU'Sv'Рис.

3. Схема сайт-специфической инверсии сегмента G в ДНК фага Mu: а – механизмреакции обмена цепями ДНК. Две линии изображают дуплекс ДНК. Инвертируемый сегмент показан зелеными линиями, два сайта вобращенных повторах на концах сегмента G,между которыми происходит обмен, выделены красным и синим цветом.

Показанатолько часть нуклеотидной последовательности обращенных повторов, где происходит рекомбинация. Буквы A, G, C и T обозначают реальные нуклеотиды в сайте обмена.Сайты разрывов обозначены ступенчатымипунктирными линиями. Для наглядности“временные” разрывы цепей ДНК показанысплошными ступенчатыми линиями. Четыресубъединицы инвертазы, осуществляющиерекомбинацию, на рисунке не показаны; б –переключение генов хвостового отросткафага Mu в зависимости от ориентации сегмента G.

Сегмент G изображен зелеными линиями, треугольники представляют его концевые обращенные повторы. Стрелки подизображением ДНК указывают направлениятранскрипции генов, а P – положение промоторов. Остальные пояснения даны в текстеPgin(G −)PScSv'U'USvPginучастки ДНК, что и лежит в основе узнавания гомологичных последовательностей. Напротив, присайт-специфической рекомбинации главную роль всинапсисе играет взаимное узнавание белков, связанных с рекомбинационными сайтами. Эти сайтысовсем короткие, и гомология между ними непосредственно для синапсиса несущественна. Она важна для связывания со специфическими белками идля обмена цепями между сайтами.íêÄçëèéáàñààРекомбинационные процессы еще одного типа –транспозиции лежат в основе перемещений подвижных генетических элементов.

Подвижные элементы – это особые последовательности ДНК, способные, как это следует из их названия, кперемещениям из одного участка молекулы ДНК(хромосомы или плазмиды) в другой, или в другуюмолекулу в той же клетке, или даже в клетки другогоорганизма. Они широко распространены как у прокариот, так и у эукариот и при этом отличаются высоким разнообразием.

Подвижные элементы, какправило, не существуют автономно, и для них характерно нахождение в составе хромосом или плазмид. В большинстве своем подвижные элементыпрокариот и эукариот построены по сходному плану и состоят из центральной части, фланкированной концевыми обращенными повторами (рис. 4).Транспозиции осуществляются особыми белками, ген (или гены) которых в основном локализованв самих подвижных элементах, в их центральнойчасти.

Главный белок транспозиции – транспозаза.Рекомбинация между подвижным элементом и тойДНК, в которую он будет встраиваться (ее называютДНК-мишенью), происходит на уровне дуплексов,не имеющих, как и в случае сайт-специфическойрекомбинации, пресинаптических фиксированныхповреждений. Поскольку рекомбинация происходит точно по концам подвижного элемента, транспозиции можно рассматривать как сайт-специфический процесс, но только в отношении самогоэлемента, так как встраивание элементов в ДНКмишень чаще всего происходит в случайные сайты.Важно отметить, что сколько-нибудь заметная гомология между подвижным элементом и ДНК-мишенью отсутствует.Некоторые подвижные элементы бактерий содержат в центральной части также гены, не имеющие отношения к транспозиции, чаще всего этофакторы устойчивости к антибиотикам, лекарственным веществам или ядам.

Такие элементы приих открытии получили название транспозонов (Tn);к ним относятся представленные на рис. 4 Tn3 иTn5. Позднее так стали называть все подвижныеэлементы. Подвижные элементы с короткими обращенными повторами (рис. 4, а) характерны для бактерий, растений и дрозофилы. Элементы с длинными обращенными повторами (рис. 4, б ) описаны убактерий. Эти длинные повторы, в свою очередь,представляют собой один из типов более простоÉãÄáÖê Ç.å. ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàü ÅÖá ÉéåéãéÉàà: èêéñÖëëõ, ÇÖÑìôàÖ ä èÖêÖëíêéâäÄå Ç ÉÖçéåÖ25tnpAtnpR blaаTn3RSNPTIIТранспозазаTn5бIS50LgagTy1IS50Rpol: PR–INT–RT–RHвРис.

4. Структурная организация некоторых подвижных элементов. Прямоугольники, ограниченные синими линиями, изображают центральныечасти элементов, красными – обращенные концевые повторы бактериальных подвижных элементов или длинные прямые концевые повторы ретротранспозона. Прямоугольники, ограниченные зелеными линиями, – прямые повторы ДНК-мишени,зеленые линии – часть ДНК-мишени, в которуювстроен подвижный элемент. Направление красных и зеленых треугольников указывает ориентацию соответствующих повторов.

Стрелки надподвижным элементом показывают направление транскрипции генов. Масштаб не соблюден.а – бактериальный транспозон Tn3. Размер около5 т.п.н., обращенные концевые повторы по 38 п.н.,прямые повторы ДНК-мишени по 5 п.н., tnpA – гентранспозазы, tnpR – ген резолвазы. Участки началатранскрипции этих генов перекрываются в рекомбинационном сайте RS (сайте разрешения коинтегратов для резолвазы), выделенном синим. bla –ген бета-лактамазы, определяющий устойчивостьк антибиотикам пенициллинового ряда; б – бактериальный транспозон Tn5. Размер около 5,8 т.п.н.,обращенные концевые повторы представлены подвижным элементом IS50 длиной 1531–1533 п.н.Левый повтор (IS50L) инактивирован в результатенонсенс-мутации, правый повтор (IS50R) кодирует транспозазу. NPTII – ген неомицинфосфотрансферазы II обеспечивает устойчивость к антибиотику канамицину.

Прямые повторы ДНК-мишенипо 9 п.н.; в – дрожжевой ретротранспозон Ty1.Размер около 5,9 т.п.н., прямые концевые повторы по 330 п.н., прямые повторы ДНК-мишени по5 п.н. С центральной части элемента, включаязначительную часть его концевых повторов, считывается единый транскрипт. Ген gag кодируетструктурный РНК-связывающий белок. Ген pol кодирует общий белок, который содержит в качестве доменов интегразу (INT), обратную транскриптазу (RT), РНКазу H (RH) и протеазу (PR). Последняя затем разрезает общий белок на отдельныеферменты. Остальные пояснения даны в текстеустроенных подвижных элементов, называемых IS(insertion sequences). В этих случаях центральнаячасть такого сложного транспозона содержит только посторонние гены, а гены транспозиции находятся в IS-элементах, причем один из них инактивирован одной или более мутациями.

У эукариот(дрожжей, простейших, насекомых, позвоночных,высших растений) распространены подвижныеэлементы, получившие название ретротранспозонов (рис. 4, в). Структура ретротранспозонов соответствует ДНК-копиям геномов ретровирусов по-26звоночных, которые также являются подвижнымиэлементами. В транспозициях ретротранспозоновзадействованы ферментобратная транскриптаза иРНК-копия элемента в качестве интермедиата (см.ниже). Ретротранспозоны подразделяются на двегруппы. К первой относятся элементы с длиннымипрямыми повторами на концах.

Вторую группу образуют элементы, не имеющие повторов на концах.Обращенные концевые повторы абсолютно необходимы для транспозиции, поскольку именно ихконцы связываются транспозазой и по ним происходит рекомбинация. У умеренного фага Mu, обладающего всеми свойствами подвижного элемента, обращенные концевые повторы состоят всего из 2 п.н.У ретротранспозонов первой группы длинные прямые повторы также заканчиваются обращеннымиповторами из 2 п.н., но несколько дальше от концовэлементов и у ретротранспозонов, и у фага Mu имеются дополнительные обращенные повторы.Все мобильные элементы за некоторыми исключениями на обоих концах содержат еще и прямыеповторы из нескольких нуклеотидов ДНК-мишени.Состав этих нуклеотидов варьирует, так как подвижные элементы внедряются в случайные сайтыДНК-мишени, но их число постоянно для каждогоэлемента.

Чаще всего оно равно 5 или 9. Механизмобразования прямых повторов будет разъяснен немного позже. Таковы общие представления о структуре подвижных элементов.Структура подвижных элементов определяетмеханизмы их перемещений. Можно выделить триосновных механизма рекомбинации при транспозициях: репликативная транспозиция, нерепликативная транспозиция и перемещение ретротранспозонов. Они будут рассмотрены чуть позже. Асначала отметим, что, хотя эти механизмы различаются в деталях, имеется общий принцип реакцийтранспозиции (рис.