Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки, страница 12

Разброс значений D55048в параллельных лунках, рассчитанный как среднее квадратичное отклонение относительносреднего значения (sd/mean, %), составлял 5 - 7%. Подбирали такую плотность посева клеток,чтобы D550 в контроле было около 1. Долю выживших клеток рассчитывали как отношениеD550 в лунке, содержавшей раствор DOX или исследуемого полимера, к среднему значениюD550 в контрольных лунках.

Цитотоксичность DOX и полимеров оценивали по максимальнойконцентрации соответствующего соединения, выше которой количество выживших клетокначинает снижаться (наибольшая нетоксичная концентрация, ННК). Также определяликонцентрацию соединения, при которой гибло 50% клеток - IC50. Статистическую обработкурезультатов проводили с помощью пакета программ Origin 8.5.2.2.6. Влияние полимеров на цитотоксичность доксорубицинаВлияние полимеров на устойчивость клеток к доксорубицину оценивали по доликлеток, выживших после их инкубации в смеси исследуемого полимера и антибиотика.Использовали два варианта постановки экспериментов.В первом варианте варьировали концентрацию DOX от 0,1 до 100 мкг/мл, тогда какконцентрация полимера во всех тестируемых образцах была одинаковой.

Контрольныйобразец содержал только полимер в той же концентрации. Такая постановка экспериментапозволяла определить концентрацию DOX, необходимую для подавления пролиферацииклеток на 50% ( IC50DOX ) в присутствии фиксированной концентрации полимера. Одновременнона том же планшете анализировали токсичность DOX для тех же клеток, но в отсутствиеполимера, как указано в п. 2.2.5. Сопоставление полученных кривых цитотоксичности DOXдемонстрирует изменение чувствительности клеток к лекарству под действием полимера.При втором варианте варьировали концентрацию полимера, а концентрация DOX вовсех образцах была одинаковой - 5 мкг/мл. Контролем служили образцы, содержавшие только5 мкг/мл DOX.

Такая постановка опытов позволяла определить концентрацию полимера,достаточную для подавления МЛУ.Подготовка реактивов, клеток и проведение экспериментов при обоих вариантаханалогичны изложенным в п. 2.2.5.2.2.7. Анализ накопления DOX в клеткахКлетки MCF7/R высаживали на стерильные покровные стекла, положенные в чашкиПетри диаметром 3 см, по 50 - 100 тыс. на стекло. На следующий день монослой клетокинкубировали с раствором 5 мкг/мл DOX в бессывороточной среде при 37°С и черезфиксированные промежутки времени клетки отмывали раствором PBS (3 раза по 2 мл) ификсировали 4% раствором формальдегида в течение 10 – 15 мин. После удаления фиксатораклетки промывали PBS (3 раза по 2 мл) и герметизировали на предметном стекле с помощью49лака.ОбразцыанализировалинафлюоресцентноммикроскопеOpton,оснащенномвидеокамерой М1400м (ДельтаТех, Россия).

Флюоресценцию регистрировали при λex = 510нм и λem = 580 нм. Для измерения ее интенсивности получали фотографии клеток в формате.tif , причем, все образцы фотографировали при одинаковом времени экспозиции. Фотографиианализировали с помощью программы анализа изображений (ДельтаТех). Интенсивностьокраски ядер в пикселях в области свободной от клеток (фон) измеряли минимум в 6 участкахна каждой фотографии. Затем измеряли интенсивность окраски ядер в 50 – 70 клетках. Впредварительных опытах была показана прямая пропорциональность между концентрациейдобавленного DOX и интенсивностью флюоресценции ядер при фиксированном времениэкспозиции при фотографировании. На этом основании мы полагали, что разность междуинтенсивностью окраски ядер и фона пропорциональна количеству DOX в ядрах.

Ранее F.Frezard и А. Garnier-Suillerot это показали на клетках эритролейкемии К562 [202].2.2.8. Получение меченных тритием полимеровВведение трития в плюроники L61 и Р123 и углеводородсодержащий ПАВ Brij-35проводил доцент Г.А. Бадун на кафедре радиохимии МГУ. Полимеры обрабатывали атомамитрития, которые образуются при 1900 К в результате термической диссоциации молекултрития. Для этого полимеры растворяли в воде и лиофильно высушивали в тонком слое настенках реакционного сосуда (площадь мишени около 150 см2), вводили в сосуд тритийпротиевую смесь (содержание трития 50%) до давления 3,7 мТор (0,5 Па) и нагреваливольфрамовую проволоку электрическим током до 1900 К.

Полимеры бомбардировалигорячими атомами трития (Е=0,16 эВ, 1900 К) в течение 10 с. Процедуру повторяли 4 раза,каждый раз растворяя полимер в воде и лиофилизуя заново. Полимеры отделяли отобмениваемого трития рядом последовательных циклов растворения в этаноле и упаривания ввакууме и очищали от продуктов радиолиза методом ГПХ на колонке сефадекса LH-20 (1×18см), уравновешенного этанолом. Фракции первого пика, содержащие радиоактивный полимер,собирали и испаряли этанол под вакуумом.

Удельная радиоактивность 3H-L61 составила 13,9Ки/ммоль, а 3Н-Р123 – 48,3 Ки/ммоль, что соответствует в среднем 0,5 и 1,7 атома трития намакромолекулу, учитывая, что удельная радиоактивность атома трития равна 29 Ки/ммоль.Удельная радиоактивность 3Н-Brij-35 была несколько ниже – 6,5 Ки/ммоль.2.2.9. РадиоавтографияЛокализациюрадиоавтографии,3H-меченыхоснованномнаполимеровполучениивклеткахизображенияанализироваливследствиеметодомвоздействияионизирующих частиц, образующихся при распаде трития, на ядерную фотоэмульсию,содержащую кристаллы галоидного серебра - AgBr.50При распаде трития образуется изотоп гелия, электрон и антинейтрино ( e ):31H  23 He1  e    eПод действием β-излучения из ионаBr (5).в микрокристалле бромида серебравыбивается электрон, который может свободно перемещаться внутри микрокристалла ипопасть в область дефектов кристаллической решётки - так называемые центрысветочувствительности.

Дефекты образуются в процессе приготовления фотографическойэмульсии, на стадии химического созревания. В кристаллической решётке присутствует такженекоторое количество свободных положительно заряженных ионов Ag+, выбитых со своихместтепловымиколебаниями.Онидвижутсяпонаправлениюкцентрамсветочувствительности, обладающих отрицательным зарядом благодаря скапливающимся вних электронам. Часть ионов Ag+ рекомбинирует с фотоэлектронами и превращается внейтральные атомы серебра. Таким образом, в центре светочувствительности образуетсязародыш металлического серебра, растущий в процессе экспозиции. Такие локальные группыатомов серебра называются центрами скрытого изображения.За сутки до эксперимента клетки высевали на покровные стекла в плотности 20 - 30тыс.

клеток на стекло и культивировали в стандартных условиях. В день эксперимента средукультивирования удаляли и добавляли к клеткам смесь 3H-меченного и немеченного полимерав 1 мл DMEM без сыворотки. Конечные концентрации полимеров и радиоактивность образцовуказаны в подписях к рис. 39 и рис. 40 . Клетки инкубировали в присутствии полимера втечение 1 ч при 37оС в СО2-инкубаторе. После инкубации клетки отмывали от полимеров PBS2-5 раз по 1 мл и фиксировали в течение 10-15 мин одним из трех способов: смесью 15 млэтанола с 5 мл ледяной уксусной кислоты или 4% формальдегидом при комнатнойтемпературеилиметаноломпри-20оС.4%формальдегидполучалигидролизомпараформальдегида в PBS в кипящей водяной бане в течение 10 - 15 мин непосредственноперед применением во избежание его закисления при хранении. После фиксации покровныестекла с клетками отмывали от фиксатора раствором PBS (4 раза по 1 мл) и приклеиваликанадским бальзамом на предметное стекло клетками вверх и высушивали.

При слабомкрасном свете в темноте наносили на клетки тонкий слой мелкозернистой ядернойфотоэмульсии. Для получения тонкого слоя эмульсии ее предварительно расплавляли втечение 30 - 45 мин в водном термостате при 42 - 44°С. Малое время прогрева и температуравыше 50°С сильно снижают чувствительность эмульсии. 1 - 2 мл расплавленной гомогеннойэмульсии наносили автоматической пипеткой на стекло с клетками и давали ей стечь. Образцыэкспонировали в темноте в присутствии осушителя (силикагель) при +4 - +5°С в течение 5-8дней и проявляли в течение 1-2 мин в темной комнате проявителем Д-19 [203], содержавшем512,2 г/л метола, 96 г/л безводного сульфита натрия, 8,8 г/л гидрохинона, 48 г/л безводногокарбоната натрия, 5 г/л бромистого калия, последовательно растворенных в воде при 35-40ºС.При опускании образцов в проявитель гидрохинон адсорбируется на микрокристаллах AgBr ивосстановливает ионы серебра в фотоэмульсии (реакция 6):2AgBr+C6H4(OH)2→2Ag+C6H4O2+2HBr(6).Такая реакция возможна только при наличии центров скрытого фотографическогоизображения, которые должны находиться на поверхности микрокристаллов для контакта смолекулами проявляющего вещества.