Структурно-функциональные закономерности воздействия амфифильных блок-сополимеров на раковые клетки, страница 11

Вряде опытов использовали и другие концентрации ДФГТ (0,25 мкМ и 8 мкМ). Образцытермостатировали в течение 1 ч при 37оС и измеряли интенсивность флуоресценции каждогообразца на флуориметре Hitachi 650-10 S (Япония) при длине волны возбуждающего света(λex) 366 нм и длине волны испускаемого излучения (λem) 433 нм. Так как на процессмицеллообразования плюроников сильно влияет температура, измерение интенсивностифлуоресценции каждого образца проводили при 37ºС в термостатируемой ячейке, температурув которой периодически проверяли в течение опыта. В процессе измерения одного из образцов44все остальные пробы находились в водяном термостате при 37оС.

Для минимизации выгоранияметки щель для прохождения возбуждающего света выставляли минимальную (1 - 2 нм). Дляповышения чувствительности определения щель для прохождения испускаемого светаувеличивали максимально до 18 - 20 нм. Измерения проводили в широком диапазонедостоверно определяемых значений интенсивности излучаемого света: от 10 до 100-120 усл.ед.Для этого подбирали такую чувствительность прибора, чтобы величина интенсивности вконтрольных образцах без полимера составляла 5 – 10 усл. ед. В настоящей работе ККМопределяли, исходя из предположения, что единичные молекулы полимера, независимо от егоконцентрации, не связывают ДФГТ. Если это так, то интенсивность флуоресценции должнабыть постоянна в отсутствие мицелл.

Поэтому, если в области концентраций полимера допредполагаемой ККМ наблюдалось небольшое, но неуклонное увеличение флюоресценции,полимер разбавляли сильнее, так, чтобы в 3-5 первых пробах ее интенсивность колебаласьоколо некоего постоянного значения, такого же, как в контрольном образце без полимера.Тогда на графике зависимости интенсивности флюресценции от концентрации полимера этизначения до ККМ лежат на прямой параллельной оси абсцисс. ККМ анализируемого полимерасоответствовала той концентрации полимера, при которой наблюдалось резкое возрастаниеинтенсивности флуоресценции ДФГТ.2.2.3.

Определение ККМ методом статического светорассеянияККМ полимеров определяли также методом статического светорассеяния, которыйоснован на зависимости интенсивности рассеяния света (I) от размера частиц: I ~ Rn, где R –радиус частиц, а n = 6 для частиц с R < 100 нм [199]. Поэтому при ассоциации макромолекулполимера с образованием мицелл происходит скачкообразное изменение интенсивностирассеянного света. Перед измерениями готовили серию разведений полимеров в PBS иобеспыливали фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм(Sartorius).

Поскольку полимеры обладают НКТР, то во избежание потерь мицелл, передфильтрованием образцы охлаждали в течение 30-60 минут при +5ºС. Обеспыленные образцытермостатировали в течение часа при 37°С и измеряли интенсивность светорассеяния нафотометре рассеянного лазерного света «Photocor Complex» («Photocor Instruments», США)под углом 90°, с He-Ne лазером мощностью 10 мВт,  = 633 нм, в качестве источника света.Показания снимали через 1 мин после помещения прогретого фильтрата в кювету,термостатируемую при 37°С. Каждый образец анализировали 5 раз. ККМ определяли какминимальную концентрацию полимера, при которой происходит резкое изменениеинтенсивности рассеянного света.452.2.4. Культивирование клетокРазмораживание клетокКлетки хранили в ампулах со средой, содержащей эмбриональную сыворотку крупногорогатого скота и 10% диметилсульфоксида (ДМСО), в сосудах Дьюара с жидким азотом.

Дляразмораживания клеток нагревали 5-7 мл 70% этанола до 37°С и помещали в него ампулу склетками. Как только среда в ампуле начинала таять, содержимое ампулы переносили вофлакон культивирования Nunc объемом 50 мл («Nunclon» Дания) с 5-7 мл культуральнойсреды DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМглютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (полная культуральная среда).Флакон с клетками помещали в СО2-инкубатор «NAPCO» (США), где инкубировали 3-4 часапри 37ºС в атмосфере 5% СО2 и влажности 95% (стандартные условия). После адгезииосновной массы клеток на стенке лежащего флакона, в нем заменяли среду на свежую, чтобыудалить ДМСО, и продолжали инкубацию в стандартных условиях.Культивирование клетокКлетки MCF7 и MCF7/R культивировали в полной культуральной среде DMEM встандартных условиях, пересевая их 2-3 раза в неделю в зависимости от плотности посева: припосеве 3×105 клеток на флакон клетки пересевали 2 раза в неделю, а при посеве 4-4,5×105клеток на флакон – 3 раза в неделю.

Для пересева клетки смывали со стенки флакона 1 млверсена (0,02% ЭДТА), который хелатирует ионы кальция, необходимые для адгезии клеток, врезультате чего происходит открепление клеток от подложки. Хелатную активность ЭДТАнейтрализовали добавлением 2 мл полной культуральной среды и осаждали клеткицетрифугированием (5 мин, 100 g, центрифуга Sigma σ-15, “Sigma Laborzentrifugen”,Германия).

Осадок клеток суспендировали в 3-4 мл среды и считали количество клеток вкамере Горяева, используя микроскоп Axiovert 25 («Zeiss», Германия). В культуральныйфлакон вносили 3-4 мл среды и суспензию клеток до получения их плотности 1,2×104клеток/см2 (3×105 клеток на флакон с площадью рабочей поверхности 25 см2).Для поддержания устойчивости клеток MCF7/R к действию противоопухолевыхантибиотиков в среду культивирования 1 раз в месяц при пересеве добавляли 5 мкг/мл DOX иинкубировали в течение трех суток в стандартных условиях. После этого среду с DOXудаляли. Для опытов использовали клетки не менее, чем после двух пассажей в среде безDOX.Проверка чистоты клеточной культурыЧистоту культуры клеток контролировали с помощью флуоресцентного красителяDAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол).

Метод основан на возрастании флюоресценции этогокрасителя при связывании с ДНК, причем не только клеток, но и микоплазмы, бактерий и46других ДНК-содержащих организмов. DAPI проходит сквозь клеточные мембраны ивстраивается в кластеры ДНК, обогащенные парами аденин-тимин, на любой стадииклеточного цикла. При встраивании эмиссия флюоресценции DAPI возрастает в 20 раз иможно наблюдать голубое свечение при длине волны λem = 460 нм. DAPI можетприсоединяться и к РНК, однако при этом интенсивность флюоресценции красителя в 5 разслабее, чем при образовании комплекса с ДНК, и регистрируется при другой длине волны λem= 500 нм, т.е. не перекрывается с λem комплекса DAPI и ДНК.Для анализа на покровное стекло, лежащее в чашке Петри диаметром 3 см, высевалиоколо 105 клеток, вносили 3-4 мл среды и инкубировали клетки в стандартных условиях втечение 2 суток. Затем среду культивирования удаляли, клетки промывали 2 раза 3 млраствора PBS и фиксировали в 2 мл холодного метанола в течение 10-15 минут при -20ºС.После фиксации метанол удаляли и промывали клетки 2 раза 3 мл раствора PBS.

Дляокрашивания ДНК в каждую чашку Петри вносили по 2 мл 0,3 мкМ раствора DAPI в PBS иинкубировали в течение 5 - 10 мин. Непрореагировавший краситель удаляли раствором PBS(промывка 3 раза по 3 мл). На предметное стекло наносили по 10-15 мкл смеси PBS иглицерина (1:1) и на нее помещали образцы на покровных стеклах клетками вниз. Покровныестекла закрепляли по краям с помощью лака и после его высыхания наносилинефлюоресцирующее иммерсионное масло 518С.

Образцы анализировали на флюоресцентноммикроскопе («OPTON», Германия) при облучении светом в диапазоне 390 - 420 нм иувеличении ×630. Если заражения нет, то синее свечение наблюдается только в ядрах клеток.При заражении культуры микоплазмой синяя флуоресценция DAPI наблюдается также нанаружной клеточной мембране и вне клеток.

В этом случае к клеткам в культуральную средудобавляли 5 мкг/мл препарата, убивающего микоплазму (micoplasma removing agent, MRA), ивыдерживали их в присутствии этого препарата в течение трех суток. Очищенную такимобразом культуру клеток использовали для экспериментов только после 2 - 3 стандартныхпересевов.Замораживание клеток для храненияКлеткисобиралисо стенки культуральногофлакона,какприпересеве,исуспендировали в 1-2 мл эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, содержавшей10% ДМСО в качестве криопротектора. После подсчета плотности клеток их переносили вампулы для замораживания по 1,5 - 3 млн клеток/ампула.

Ампулы помещали в толстостенныештативы из пенопласта и выдерживали сутки при температуре -40°С, после чего переносили всосуд Дьюара с жидким азотом.472.2.5. Определение цитотоксичности доксорубицина и полимеровЦитотоксичность DOX и полимеров оценивали по доли клеток, выживших послеинкубации с указанными соединениями (антибиотик или полимер). Для анализа устойчивостиклеток к DOX, его навеску массой 5 мг растворяли в 300 мкл дистиллированной воды,определяликонцентрациюпооптическойплотностирастворапри490нмнаспектрофотометре Ultrospec 500/1100 pro ("Amersham Biosciences" США), принимая значениекоэффициента экстинкции равным 10500 M-1см-1 [200]. Полученный раствор разводили средойDMEM без сыворотки до концентрации 100 мкг/мл, стерилизовали фильтрованием черезфильтр с диаметром пор 0,45 мкм и последовательно разводили DOX средой DMEM безсыворотки для получения растворов в диапазоне концентраций 0,1-100 мкг/мл.

Приконцентрации ≥ 300 мкг/мл DOX сорбируется на полистирольном планшете, что искажаетрезультаты анализа его токсичности.Для исследования токсичности полимеров их растворяли в среде DMEM без сывороткив течение суток при 40С, стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,45мкм и непосредственно перед экспериментом готовили серию его разведений в 1,5-2 раза всреде DMEM без сыворотки.Клетки MCF7/R засевали в лунки 96-луночного планшета (3500 - 4000 клеток на лунку)за сутки до эксперимента и культивировали в стандартных условиях в среде DMEM,содержащей сыворотку. В день опыта среду культивирования удаляли, в каждую лункувносили 200 мкл исследуемого соединения (DOX или полимер) и инкубировали в течение 1 ч вСО2-инкубаторе при 37ºС.

Контрольные лунки содержали только 200 мкл среды DMEM безсыворотки. Каждый образец анализировали в трех параллелях. По окончании инкубации средуинкубации заменяли на DMEM с сывороткой и культивировали клетки в течение трех суток встандартных условиях.После этого определяли количество клеток в лунках планшета с помощью МТТ-теста,который основан на способности сукцинатдегидрогеназы живых клеток восстанавливатьнеокрашенный субстрат 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) вфиолетовый кристаллический формазан, растворимый в ДМСО.

Интенсивность окраскиполученных растворов пропорциональна концентрации живых клеток [201].Раствор МТТ, 5 мг/мл в воде, хранили при 4°С. Перед анализом его разводили в 5 разсредой DMEM без сыворотки. Для определения количества живых клеток во все лункивносили по 50 мкл раствора МТТ в среде (конечная концентрация МТТ в лунке – 0,2 мкг/мл).Через 3 - 4 ч инкубации в стандартных условиях среду удаляли, вносили во все лунки по 100мкл ДМСО, перемешивали в течение 10-15 минут и измеряли оптическую плотность растворав лунках при 550 нм (D550) на фотометре Multiscan («Titertek», США).