Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации, страница 11

При этом происходила исчерпывающая экстракция АТФ изклеток.Для измерения концентрации АТФ 50 мкл экстракта из клеток вносилось в кюветулюминометра, содержащую 50 мкл люциферин-люциферазного реагента.Для построения калибровочного графика использовались стандартные растворыдинатриевой соли АТФ в концентрации 10-8÷10-5 М.Расчет концентрации АТФ (моль/г) для иммобилизованных клеток в образцепроводился по формуле:52[ATP]экстраг.

=I  V1  [ ATP]ст.  Vст.,m  Vэкст.  I ст.  V2где I – интенсивность свечения образца, мВ;Iст. – интенсивность свечения стандарта, мВ;V1 – объем реакционной смеси до добавления стандарта АТФ, мл;V2 – объем реакционной смеси после добавления стандарта АТФ, мл;Vэкст. – объем экстракта, мл;Vст. – объем стандарта АТФ, мл;[АТР]ст. – концентрация АТФ в стандартном растворе, моль/л;m – масса клеток, иммобилизованных в криогель ПВС (г), отнесенная к объемуреакционной смеси (л).Для свободных клеток расчет концентрации внутриклеточного АТФ производилсяаналогично расчету для иммобилизованных клеток, однако в этом случае отсутствовалавеличина m и полученный результат имел размерность моль/л.2.2.5.

Проведение и оценка эффективности гидролиза клеток микроводорослейC. vulgaris2.2.5.1. Проведение кислотного гидролиза-КислотныйгидролизбиомассымикроводорослейC.vulgarisC-1безеепредварительной обработкиНакопленнаябиомассамикроводорослейC.vulgarisC-1осаждаласьцентрифугированием (8000 об/мин, 10 мин), осадок ресуспендировался в 0,4÷2,0 н растворахH2SO4 или HCl, далее полученная суспензия подвергалась термолизу в автоклаве в течение25-70 мин при температуре 108, 121 0С и давлении 0,5, 1,0 ати соответственно.

Исходнаяконцентрация биомассы микроводорослей во всех экспериментах была одинакова и равна 20г сух. в-в/л. По окончании процессов производилась нейтрализация кислоты 2,5 М растворомNaOH, и из реакционной смеси отбирались пробы для определения концентрации ВС иглюкозы.-Кислотный гидролиз биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 с ее предварительноймеханической дезинтеграциейПредварительная механическая дезинтеграция биомассы микроводорослей C.

vulgarisC-1 проводилась в шаровой мельнице Mini-BeadBeater-24 (размер стеклянных бус 0,5 мм,скорость вращения ротора 3000 об/мин, в ячейки объемом 0,5 мл загрузка биомассысоставляла по 80 мг по сух. в-вам) в течение 3-5 мин. Степень дезинтеграции биомассыоценивалась микробиологическим методом с использованием счетной камеры Горяева и53рассчитывалась как процентное отношение разницы значений количества целых клеток вобразце определенного объема до и после дезинтеграции в течение определенногопромежутка времени к исходному количеству клеток.

Дезинтегрированная таким образомбиомасса C. vulgaris C-1 далее подвергалась кислотному гидролизу растворами H2SO4 вуказанных выше условиях.2.2.5.2 Проведение ферментативного гидролиза-Ферментативный гидролиз биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 без еепредварительной обработкиНакопленная биомасса микроводорослей C. vulgaris C-1 осаждалась из среды ростацентрифугированием (8000 об/мин, 10 мин), осадок влажной биомассы ресуспендировался вNa-ацетатном буфере (рН 5,5), в полученную суспензию вносился комплекс ферментныхпрепаратов. Концентрация биомассы при этом была 20 г сух.

в-в/л. Гидролиз проводился при37 0С в течение 20 ч. Через определенные промежутки времени из реакционной смесиотбирались пробы для определения концентрации ВС и глюкозы.-ФерментативныйгидролизбиомассымикроводорослейC.vulgarisC-1сеепредварительным термолизомПредварительный термолиз биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 проводился вNa-ацетатном буфере (рН 5,5) при температуре 108, 121oС и давлении 0,5, 1 ати,соответственно, в течение 15÷60 мин.

Исходная концентрация биомассы при этом была 20 гсух. в-в/л. Предобработанная таким образом биомасса C. vulgaris С-1 далее подвергаласьферментативному гидролизу в указанных выше условиях.-ФерментативныйгидролизбиомассымикроводорослейC.vulgarisC-1спредварительной обработкой ее ИЖПредобработка ИЖ биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 осуществлялась сиспользованием 1-бутил-3-метилимидазолия хлорида ([Bmim]Cl). К навеске биомассыдобавлялась навеска ИЖ. Массовая доля биомассы микроводорослей в смеси с ИЖ по сухимвеществам составляла 4%.

Полученная смесь выдерживалась в сухожаровом шкафу втечение 30, 60 мин при температуре 100, 120 0С. Далее ИЖ удалялась следующим образом:рабочаясмесьресуспендироваласьвдистиллированнойводе,подвергаласьцентрифугированию (10000 об/мин, 3 мин), после чего с осадком проводилась повторнаяоперация до тех пор, пока концентрация ИЖ в промывных водах составляла не более 0,2 г/л(концентрация ИЖ определялась спектрофотометрически по оптической плотности растворапри длине волны 210 нм). Предобработанная таким образом биомасса C. vulgaris C-1 далееподвергалась ферментативному гидролизу в указанных выше условиях.54-ФерментативныйгидролизбиомассымикроводорослейC.vulgarisC-1сеепредварительной механической дезинтеграциейПредварительная механическая дезинтеграция биомассы микроводорослей C.

vulgarisC-1 проводилась в шаровой мельнице Mini-BeadBeater-24 (размер стеклянных бус 0,5 мм,скорость вращения ротора 3000 об/мин, в ячейки объемом 0,5 мл загрузка биомассысоставляла по 80 мг по сух. в-вам) в течение 4 мин. Дезинтегрированная таким образомбиомасса C. vulgaris С-1 далее подвергалась ферментативному гидролизу в указанных вышеусловиях.2.2.6 Получение органических кислот-молочной кислотыТрансформация ферментолизатов биомассы микроводорослей C.

vulgaris C-1 вмолочную кислоту под действием иммобилизованного биокатализатора (ИБК) на основеклеток мицелиального гриба R. oryzae F-814 осуществлялась при 28 оС в аэробных условияхс постоянным перемешиванием (180 об/мин) в течение 40 ч. Соотношение жидкой и газовойфаз в мини-реакторе составляло 0,2. Для поддержания pH 6,6±0,2 использовался 2,5 Мраствор NH4OH. Начальная концентрация ИБК была 30 г сух. в-в/л.-фумаровой кислотыТрансформация ферментолизатов биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 вфумаровую кислоту под действием ИБК на основе клеток мицелиального гриба R.

oryzaeF-1032 осуществлялась при 28 оС в аэробных условиях с постоянным перемешиванием (180об/мин) в течение 40 ч. Соотношение жидкой и газовой фаз в мини-реакторе составляло 0,2.Начальная концентрация ИБК была 30 г сух. в-в/л.-янтарной кислотыТрансформация ферментолизатов биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 вянтарную кислоту под действием ИБК на основе клеток бактерий A. succinogenesосуществлялась при 37 оС в анаэробных условиях с постоянным перемешиванием (180об/мин). Соотношение жидкой и газовой фаз в мини-реакторе составляло 0,5.

Значение рН вгидролизате устанавливалось на уровне 6,8±0,2 при использовании 2 М раствора Na2CO3 иподдерживалось на этом уровне введением в среду MgCO3. Начальная концентрация ИБКбыла 20 г сух. в-в/л.2.2.7 Биосорбция клеток микроводорослей C. vulgarisБиосорбция клеток микроводорослей C. vulgaris С-1 из сточных вод осуществляласьиммобилизованными клетками мицелиальных грибов R. oryzae F-814 и R. oryzae F-1032,55многократноиспользованнымивпроцессахполученияорганическихкислотизферментолизатов биомассы микроводорослей C.

vulgaris С-1. Процесс проводился при 28 оСв аэробных условиях с постоянным перемешиванием (180 об/мин) в течение 24 ч.Соотношение жидкой и газовой фаз в мини-реакторе составляло 0,2.2.2.8 Получение метанаТрансформациябиомассымикроводорослейC.vulgarisC-1,клетокиммобилизованных мицелиальных грибов R. oryzae F-1032 и их смесей осуществляласьсогласно ранее разработанному способу [13]. В качестве биокатализатора метаногенезаиспользовался анаэробный ил, взятый с очистных сооружений завода по изготовлениючипсов ФритоЛей (г.

Кашира) из действующего анаэробного реактора. Анаэробный ил имелследующие характеристики: беззольное вещество биомассы (БВБ) – 35,5 г/л; метаногеннаяактивность – 252,3 мг ХПК/г БВБ/сут; сухой вес – 57,2 г/л; зольность – 38,0%. Процессметаногенеза проводился при термостатировании реакторов при 35оC. Все образцыбиомассы перед началом метаногенеза подвергались термообработке при 108оС и 0,5 ати втечение 0,5 ч.2.2.9 Получение пиролизной нефтиПиролиз биомассы микроводорослей C. vulgaris C-1 и ее смеси с иммобилизованнымиклетками мицелиальных грибов R. oryzae F-1032 осуществлялся в термогравиметрическоманализаторе в атмосфере N2 при температуре 500 0С в течение 5 мин известным способом[178]. По окончании пиролиза твердая и жидкая фракция экстрагировались CH2Cl2,отделялись фильтрованием и после испарения CH2Cl2 взвешивались. Жидкие фракциипродуктов превращения образцов исследовались методом хромато-масс-спектрометрии сиспользованием хромато-масс-спектрометра Trace 1300 ISQ (Thermo Fisher Scientific, США).2.2.10 Получение ПГАТрансформация ферментолизатов биомассы микроводорослей C.

vulgaris C-1 в ПГАпод действием клеток бактерий С. necator осуществлялась при 28 оС в аэробных условиях спостоянным перемешиванием (180 об/мин) в течение 15 ч. Соотношение жидкой и газовойфаз в мини-реакторе составляло 0,2. Для поддержания рН 7,0±0,2 использовался 2 М растворКОН. Начальная концентрация бактерий С. necator составляла 5 г сух. в-в/л.562.2.11 Определение ХПКХПК определялось бихроматным методом, в котором в качестве окислителяиспользовался K2Cr2O7, при этом Cr(VI) восстанавливается до Сr(III) c изменением окраскираствора с оранжевого в зеленый.В пробирки с герметичными пробками последовательно вносилось 3 мл H2SO4 (конц),200 мг смеси Ag2SO4 м HgSO4 в весовом соотношении 1:1, 1.3 мл 0,2083 н раствора K2Cr2O7бихромата калия и 2,1 мл исследуемого образца.