Отзыв оппонента Мельникова Г.В. (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов)

В диссертационный совет Д 501.001.67ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТАдоктора химических наук, профессора кафедры физика федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А. Мельникова Геннадия Васильевича на диссертацию КулешовойАнны Александровны «Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов» на соисканиеученой степени кандидата физико-математических наук по специальностям01.04.05 – оптика и 03.01.02 – биофизикаДиссертационная работа Кулешовой А. А.

посвящена исследованиюпроцессов взаимодействия наномаркеров ксантенового ряда: флуоресцеина,эозина, эритрозина и бенгальского розового с белками: сывороточным альбумином человека (САЧ) и бычьим сывороточным альбумином (БСА).Актуальность темы диссертационного исследования. Современноеразвитие молекулярной спектроскопии непосредственно связано с проблемойсоздания все новых методов исследования состояния живых организмов, чтопозволит осуществить диагностику целого ряда заболеваний на ранней стадии.Среди наиболее перспективных следует выделить методы флуоресцентной спектроскопии, как методы неразрушающего контроля, которые позволяют работать с малыми концентрациями и малыми объемами пробы.

Вэтой связи большую значимость приобретают спектрально-люминесцентныеисследования с применением флуоресцирующих наномаркеров - красителей,получивших широкое распространение в биофизике, медицинской диагностике, аналитической химии и т.д. Наномаркеры, нековалентно связанные сбелками, обладают высокой чувствительностью к изменению среды, в которой находятся белки, к структурным изменениям в белках, а также реагируютна различные веществ, связывающиеся с белками в плазме крови.Степень обоснованности научных положений, выводов и практических рекомендаций, сформулированных в диссертации.Обоснованность, представленных в работе научных положений определяется изученными фотофизическими процессами, протекающими в наномаркерах, помещенных в микрогетерогенные среды, а также чувствительностью спектрально-флуоресцентных и абсорбционных характеристик наномаркеров к изменению физико-химических свойств биологических сред.1Степень обоснованности научных выводов определяется продуманнымвыбором объектов исследования: наномаркеров и белков, научно обоснованным выбором методов исследования с современной технической базой ипроведением экспериментов, направленных на выяснение механизма взаимодействия наномаркеров с белками, а также применением уравнений, полученных Н.Г.

Бахшиевым, которые используются для анализа полученныхэкспериментальных результатов.Выбор наномаркеров ксантенового ряда, позволил осуществить плавное изменение ионных форм красителей при изменении рН растворов белков,что определило успешное проведение исследований изменения свойств белков при изменении рН среды. Автором выбраны САЧ и БСА поскольку ониимеют характерные центры связывания с лигандами и проявляют способность к структурным изменениям при изменении физико-химическихсвойств среды, в которую они помещены.Вывод об изменении дипольного момента наномаркеров в возбужденном состоянии при переходе от буферного раствора к раствору белков сделанна основании полученных экспериментальных результатов по обнаруженному длинноволновому смещению максимума флуоресценции и рассчитанномузначению дипольного момента электронных переходов в молекулах наномаркеров.Сорбция наномаркеров на глобулы белков определена на основании зарегистрированного уменьшения интенсивности флуоресценции наномаркеров при добавлении в буферный раствор белков.

Для количественной характеристики этого процесса из уравнения Штерна-Фольмера определена константа связывания наномаркеров с глобулами белков.Основанием для возможного существования разных ионных форм красителя при изменении рН раствора послужило обнаруженное возрастаниеинтенсивности флуоресценции наномаркеров при возрастании рН раствора.Изменение интенсивности флуоресценции наномаркеров, связанных с белками при изменении рН послужило также основанием для вывода об изменении количества посадочных мест при сорбции красителей на глобулу белка.На основании теории Оствальда и полученных из эксперимента данных: показатель поглощения ассоциатов, константы равновесия, силы осцилляторов электронных переходов в димерах и мономерах, автором определенпараметр, характеризующий структуру димеров: угол между молекуламикрасителей в димере. Зависимость этого параметра от рН раствора позволилоопределить структурные изменения в димерах наномаркеров.Применение теории поляризации флуоресценции наномаркеров позволило автору установить, что при переходе от буферных растворов к белко2вым растворам возрастает время вращательной релаксации и уменьшаетсякоэффициент вращательной диффузии наномаркеров.

Обнаруженное автором увеличение анизотропии флуоресценции наномаркеров при переходе отбуферных растворов к растворам, содержащим белки, явилось еще однимэкспериментальным доказательством сорбции наномаркеров на глобулы белков.Практические рекомендации в диссертации Кулешовой А.А. основанына исследовании процессов взаимодействия наномаркеров с белками. Обнаруженное изменение интенсивности флуоресценции при изменении рН растворов может быть использовано в медицинской диагностике ряда заболеваний, приводящих к изменению рН среды в которой находятся белки. Установлено, что наиболее чувствительной является флуоресценция флуоресцеина к изменению физико-химических свойств среды.Из анализа значений эффективных радиусов Эйнштейна при переходеот буферных растворов к растворам белков показано, что не все наномаркеры, растворенные в белковом растворе, связываются с глобулами белка.

Этоважно учитывать при использовании наномаркеров в диагностике состоянийбелков. Также показано, что при использовании наномаркеров необходимоучитывать процесс образования ассоциатов (димеров) наномаркеров, эффективность которого уменьшается при переходе к белковым растворам. На эффективность образования ассоциатов оказывает существенное влияние значение электроотрицательности боковых радикалов галоген-производныхфлуоресцеина.Таким образом, диссертационная работа Кулешовой А.А.

«Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворахсывороточных альбуминов» содержит новую информацию о механизмахвзаимодействия наномаркеров с белками и результаты могут быть использованы при разработке методов флуоресцентной диагностики ряда заболеваний.Вместе с тем по работе имеется ряд замечаний:1.На стр. 61 представлены спектры поглощения бенгальского розовогоконцентрацией 50 мкМ.

Как при таких значениях оптических плотностейучитывался возможный эффект перепоглощения в наномаркерах при обработке полученных результатов?2.По моему мнению, для обнаруженного автором уменьшения интенсивности флуоресценции красителей при добавлении белка в буферный растворлучше ввести термин «уменьшение интенсивности флуоресценции наномаркеров» вместо термина «тушение флуоресценции наномаркеров» белками.3.Замечания по стилю:3стр.75 , 1-ый абзац, 5 –ая строка:Напечатано: «Из рис. 3.37 видно, что зависимости ΔD САЧ (С) и ΔD САЧ (рН)практически одинаковы соответствующим зависимостями для БСА …»Надо: «Из рис. 3.37 видно, что зависимости ΔD САЧ (С) и ΔD САЧ (рН) практически совпадают с соответствующими зависимостями для БСА …»Приведенные замечания не имеют принципиального характера и непринижают значимость полученных результатов.

В качестве пожеланияможно посоветовать соискателю продолжить исследования на других биологических объектах с применением других люминесцентных зондов разработанными методами.Личный вклад соискателя в разработку научной проблемы, репрезентативность материала, полученных в результате проведённых экспериментальных исследованийЛичный вклад автора проявляется в обосновании выбора объектов исследования, проведении экспериментов, описании и обработке полученныхрезультатов. Содержание диссертации, положения, выносимые на защиту, ивыводы из работы отражают личный вклад автора в опубликованные работы.В работе следует отметить высокую репрезентативность материала,полученного в результате многократного повторения, проведённых экспериментальных исследований.

Грамотно подобранные методы экспериментальных исследований, методика пробоподготовки и методы обработки результатов исследований с применением современных программ компьютерной обработки позволили автору работы получить достоверные результаты, которые не противоречат существующим воззрениям на данную проблему.Оценить содержание диссертации, её завершённость, подтвердитьпубликации автора.Диссертация состоит из введения, трех глав, в первой из которых представлен обзор литературы по теме диссертации, во второй изложена методика эксперимента и обработки полученных результатов, в третьей приведеныэкспериментальные результаты и их обсуждение, также работа содержит заключение и библиографию. Общий объем работы 121 страница, включающий 62 рисунка и одну таблицу. Библиография содержит 133 наименования.По насыщенности экспериментальными результатами, а также по содержанию и методам обработки полученных результатов, по качеству оформленияработа Кулешовой А.А., соответствует требованиям, предъявляемым ВАК кдиссертационным работам.Заключение о соответствии диссертации и автореферата требованиям, установленным Положением о порядке присуждения учёных степеней;4.