Отзыв оппонента Горелика В.С. (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов)

ОТЗЫВофициального оппонента на диссертационную работу Кулешовой АнныАлександровны«Флуоресцентныехарактеристикинаномаркеровсемейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов»,представленную на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук по специальностям 01.04.05 – оптика и 03.01.02 –биофизика.Сывороточные альбумины человека (САЧ) и быка (БСА) входят всостав плазмы крови и выполняют важную функцию, связанную странспортом метаболитов, переносимых кровью. Молекулы сывороточныхбелков САЧ и БСА имеют похожую молекулярную структуру и состоят избольшого числа аминокислотных остатков, реагирующих на кислотностьокружающей среды и на присутствие различного рода молекулярныхсоединений в плазме крови.

Важной проблемой молекулярной биофизикиявляется установление молекулярной структуры сывороточных белков ихарактера их взаимодействия с окружающей средой. Для полученияинформации о взаимодействии белков с окружающими их молекулами можетбытьиспользованметодфлуоресцентныхметок-флуоресцентныхнаномаркеров (зондов), очень чувствительных к присутствию вблизимолекул белков посторонних молекул. В качестве такого рода зондов вмолекулярнойбиофизикеиспользуютмолекулыразличныхтиповкрасителей. В диссертационной работе Кулешовой Анны Александровныисследовались характеристики спектров фотолюминесценции и поглощениянаномаркеров семейства флуоресцеина в буферных растворах и в водныхрастворах САЧ и БСА.

Была поставлена задача экспериментальногоисследованиявидаспектровфотолюминесценции,спектрально-поляризационных характеристик и абсорбционных свойств сывороточныхбелков и наномаркеров в зависимости от рН окружающей среды и типафлуоресцентного маркера. Решались конкретные задачи установления1спектрально-флуоресцентныххарактеристикнаномаркеровсемействафлуоресцеина (флуоресцеин (Ф), эозин (Э), эритрозин (Эр) и бенгальскийрозовый (БР)) в водных растворах белков САЧ или БСА при варьированиизначения pH и нахождения констант связывания этих наномаркеров белком.Решение таких задач является весьма актуальным, так как на основе данныхо флуоресцентных маркерах, мгновенно реагирующих на изменения вокружающей среде, устанавливаются закономерности взаимодействия белкас лигандом или с лекарственным препаратом, представляющие интерес дляприложений.Такимобразом,задачи,решаемыевдиссертационнойработеКулешовой Анны Александровны, представляются весьма важными как дляразвитиятеориивзаимодействиямолекулбелковсактивнымимолекулярными соединениями, так и с практической точки зрения, дляразвития метода флуоресцентных наномеркеров с целью диагностикисостояния биологических сред.Экспериментальныеисследованияспектровпоглощенияифотолюминесценции были проведены для буферных растворов, содержащихнаномаркеры Ф, Э, Эр и БР, и для наномаркеров в водных растворах САЧ иБСА при различных концентрациях наномаркеров (10-150 мкм) и приразличных значениях pH (3,5-8,0).

Для оценки изменений pH под влияниемСАЧ, БСА и наномаркеров были проделаны специальные эксперименты, врезультате которых было показано, что это влияние крайне незначительно.Измерения спектров поглощения наномеркеров, введённых в растворыСАЧиБСА,былипроведенысиспользованиемсовременнойэкспериментальной установки на основе спектрофотометра типа Perkin ElmerLambda 35. Спектры поглощения наномаркеров регистрировались вдиапазоне 300-700 нм с применением стандартных кварцевых кювет. Анализнаблюдаемых спектров поглощения осуществлялся с использованиемапробированной цифровой программы UVWINLAB.2Длярегистрацииспектровфотолюминесценциииспользовалсясовременный спектрофлуориметр Perkin Elmer LS 55. При этом возбуждениеспектровфотолюминесценцииосуществлялосьмонохроматическимизлучением с различными длинами волн: 440, 520, 530 и 540 нм.Соответственно спектры флуоресценции регистрировались в диапазоне 450700 нм.

Анализ спектров флуоресценции проводился с использованиемапробированной цифровой программы UVWINLAB.Таким образом, экспериментальные результаты, представленные вдиссертации, получены на современной спектральной аппаратуре. Ихнадёжностьидостоверностьневызываетсомнений.Полученныеэкспериментальные результаты являются оригинальными и дополняютаналогичные исследования по спектроскопии наномаркеров в биологическихструктурах, опубликованные ранее.Основные научные результаты диссертационной работы КулешовойАнны Александровны состоят в следующем.1. Обнаружено, что интенсивность фотолюминесценции красителей Ф, Э, Эри БР в водных растворах САЧ и БСА уменьшается, по сравнению ссоответствующей интенсивностью в буферных растворах.

При этомустановлено, что с увеличением pH тушение флуоресценции под действиембелков для наномаркеров Э, Эр и БР в растворах, содержащих САЧ и БСА,уменьшается.2. Показано, при введении наномаркеров Ф, Э, Эр и БР в водные растворы,САЧ и БСА, наблюдается длинноволновый сдвиг максимума спектрафотолюминесценции, по сравнению с аналогичными спектрами в буферныхрастворах.3. На основе анализа спектров поглощения растворов, содержащихнаномаркеры Ф, Э, Эр и БР, показано, что при достаточно большойконцентрации наномаркеров формируются ассоциаты. При этом обнаружено,3что в водных растворах САЧ и БСА степень ассоциации наномаркеровуменьшается, по сравнению с соответствующими значениями в буферныхрастворах.4.Наосновеанализаполяризационныххарактеристикспектровфотолюминесценции определены коэффициенты вращательной диффузии Ф,Э, Эр и БР и обнаружено их уменьшение в водных растворах САЧ и БСА вшироком диапазоне pH (3,5-8,0), по сравнению с буферными растворами.5.

Показано, что спектральные характеристики наномаркеров Э, Эр и БР,введённых в водные растворы САЧ и БСА, имеют близкие значения,отличающиесяотсоответствующихспектральныххарактеристикфлуоресцеина.Полученные экспериментальные результаты интерпретированы врамках развитой к настоящему времени теории. Представленные выводыявляются оригинальными, достоверными и хорошо обоснованными.Остановимся на некоторых недостатках, присутствующих в даннойработе.1. В диссертации выполнена большая экспериментальная работа, нодетали проведенных экспериментов отсутствуют.

В частности, неприведенысхемыэкспериментальныхустановок,отсутствуютсведения о характеристиках возбуждающего излучения, о типахиспользуемых поляризационных устройств и др. В результатевоспроизведение результатов, полученных в данной диссертации,оказывается затруднительным.2. В автореферате выводы об основных результатах в виде пунктов 3 и 7об уменьшении коэффициентов вращательной диффузии в водныхрастворах САЧ и БСА, по сравнению с буферными растворами,практически совпадают.4Оценивая диссертацию Кулешовой А.

А. в целом, следует отметить, чтонесмотря на приведённые недостатки, носящие технический характер, вданнойработеполученыважныенаучныерезультатыоспектрахфотолюминесценции и поглощения наномаркеров Ф, Э, Эр и БР, введённых вводные растворы САЧ и БСА. Полученные экспериментальные результаты отушенииидлинноволновомсдвигеспектровфотолюминесценции,зависящих от характеристик окружающей среды, открывают практическиевозможностидляиспользованияобсуждаемыхнаномаркеровпридиагностике патологий и типов молекулярных структур, присутствующих висследуемых биофизических объектах.

Установленные условия образованияассоциатовнаномаркеровпозволяютнайтидиапазонконцентрацийнаномаркеров, при котором их спектр соответствует мономолекулярнымструктурамкрасителейтеоретическиевподходыфотолюминесценциифотолюминесценциирастворе.дляиИспользуемыеописаниясдвигапредставляютсядальнейшего развития теории процессовдиссертациипроцессовдлинноволновогонаномаркероввтушениявспектрахважнымидлявзаимодействия белков снаномаркерами.Таким образом, диссертационная работа Кулешовой А. А., выполненнаяна «стыке» оптики биофизики, представляет как общенаучный, так ипрактический интерес. Полученные в этой работе результаты опубликованыв ведущих научных изданиях, апробированы на научных конференциях имогутбытьиспользованыширокимкругомучёныхипрактиков,занимающихся оптическими исследованиями биофизических объектов.Текст автореферата достаточно точно отражает содержание диссертации.На основании вышеизложенного считаю, что диссертационная работаКулешовой А.

А отвечает всем требованиям ВАК РФ и требованиямПоложенияоПостановленияпорядке№842присужденияПравительства5учёныхстепенейРФ24отвсентябряредакции2013 г.,.