Отзыв ведущей организации (Флуоресцентные характеристики наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах сывороточных альбуминов)

Раавйтйе сиектрально-л1оминесиейтйых методов реГйстранйи йзменеийй конформанйонйых состоаннй й фуйкииоиальйой актйвйостй бйолоГйческйх макромолекул является Важным направлением современной мО" лекуларной биофизики, сопрЯ2кенным с ОптосеисорйкОЙ и созданием новых сйстем люмййеснейтноГО медйнййскоГО моййторйнГВ, Натйвйые белковые структуры иредставляют собой снеийфйческйе молекулярйые найосистемы с селективным Откликом на действие различных ВозмушаюФйх факторов: тепловых, электромаГнйтных, хймнческйх и биолОГйческйх. Молекулярные люминеснейтйые метки, В качестВе котОрых частО исиольауют бйолОГйческй совместймые МолеКуЛЫ ОрГаническйх красителей ксай- тейОВОГО рада, Я~~а~тса удобйымй ййдикаторамй состоаний иротеййоаых сйстем, слабо Воамушаюшймй изучаемый Обьект, как В сиектральном, так й В биолОГнческОм плане.

Дйссертацйонйал работа Кулешовой А.А. ЛосВЯщена исследованию сиектралыю-флуореснентных, снектрааьно-иолярйааниойных й абсорбийонйых характерйстйк люмйнесйейтных молекулярйых аоидов (наномаркеров — по термийОлОГНН автора)„сформированных иа ОснОВе красителей флуОреснеинОВОГО ряда (флуоресиенн и еГО ГалОГеизамещенные айалОГИ) В растворах альбумййа с различными зйачеййлмй рН, й Оиределеййю йабора и Зиачений параметров, характеривуюших сОстояиия маркеров, ааресно связаййых с белкамй альбуминовоГО семейства, В сйл5 прййадлежйостй Одйому ГомолоГйческому семейству сывороточные оелкй (человеческий й бычйй) имеют ~хожую структуру, с блйзкйми чйсламй амййокйслотйых остатков: 585 и 532.

Прн соответствующих рН вторичные структуры этих белков содержат прйблйзйтельйо Одййаковое колйчество рекулярйых субструктур. Большое значение в изучении функциональных и структурных характеристйк связываюкцих цейтров б~лков прйобрел ~Стол флуоресцентных МОлекулЯриых зОндОВ, Обладаюший ВьГООХОЙ чувствительностью к ма" лым структурнь~м й зарядовым йзмейеййям окружаюкцей белковую цепь среды.

Развитие спектральйь~х Ме~одов днаГностйрования с целью повышение нх инфОрматиВности Осушествляется перманентно, В тОм числе — за счет синтеза нОВых ОрГанических красителей, расширеиия ГомолОГическОГО ряда схОжих по сВОйстВам соединений„используемь$х В качестве люмийесцейтйых Меток. Предсказуемое йзмененйе параметров Зонд~ прй переходе к очередйому члейу ряда дает унйкальйые возможностй йдентйфйкацни конформационных изменений, претерпеваемых белковой структурой. Кроме ТОГО, аь-Гйвация радиацйойнОГО кайала в спектральйой по~ос~ фосфоресценции молекулярных меток способсквует решению ряда задач, практически неразрешимых в рамках чисто флъоресцентиОГО спектральноГо анализа, Таким образом, актуальность диссертационной работы Кулешовой А.А. Является безусловйоЙ, Ввиду йсключйтельйой Важностй ййформаций о конформацнонных перестройках в белках для молекулярной биолоГИН, бйОфизики и друГих, смежных с ними разделОВ науки и технолОГических приложений.

В дйссертацйи былй поставлейы й успешно решены следуюш~е задачи. Проведены систематические измерения спектрально- флуоресцентных характеристик молекулярных маркеров В растворах сывороточных Вльбуминов при различных концентрациях белков и зондОВ В широком дйапазойе зйачейий рН растворов. Подробйо проанализирован характер изменеинй параметров люмииесцентных сиГналов и связанных с ними пе" рестроек структуры белковы~ сйстем.

Так, например, диссертантом определены константы связывания люмйнесцентных зондов с белкамй и коэффициенты кООператйВности этОГО процесса. Проведен анализ процессов ассоцйацин Молекул красителей, применяемых в Качест~е люмййесцентных меток, Определена структура ассоцйатов, а также степейь влйяййя белков йа процессы аГреГаций й Ооразоваййя компл~~с~в с протеинами. Сйстематйческйе йзмереййя спектров полярйзоваййой флуоресценций молекулярйых маркеров позволйлй Определйть параметры ОрйейтацйонйОЙ п~дв~Ж- ности ('коэффициенты Врашательйой диффузии) зойдов В растворах сывороточных альбумийов прй разлйчных зйачеииях рН бел~оных растворов. Реализованный В диссертации спектральный метод йзмеренйя люмйнесцентных сиГналОВ, характеристик пОГлощения и степени поляризации излучения белковыХ 1застворой Позволил корректйо Осуществйть процедуру идентификации конформационйых перестроек исследованных протеиИОВых наносистем, учйтыВающую специфику строения структурных единиц, входяшйх й йх состав, а такж~ Особенности межмолекулярного йзаимодействия.

Перечень Ооластей современной йауки и техййки, для которых полученйе йовых результатов В даййом йаправлении является чрезвычайно актуальным достаточйо шйрок — зто молекулярная биологи~ й про*сомика, Оптическая спектрОскопия супрамолекулярных комплексоВ и динамика пО" лнмерных субструктур, ИОВьге медицинские технолоГии, ОсОбеннО В Области ГематолоГии. В структурном отношении диссертация Кулешовой А.А. содержит ВВОдную часть„основную часть из трех Глав, а также перечня основных результатов, Выводов й Списка цитируемой литературы. Ооший Обьем работы составляет 121 страницу, Включаюших 62 рисунка и одну Т~б~~цу, а Также список нз 133 цитйруемых литературных источйикОВ.

ВО Введений показана актуальность Выбраййого направления исследОВаннй, сформулированы цели и задачи, Отражена научная НОВизна и практическая зйачимость работы, приведейо Краткое содержайие ее по гла- В 1 лаве 1 Обсуждаются известные спект1юскопические исследоВВНИЯ Взаймодействйй различных красителей, имеюшиХ достаточйо Высо~ий кван говый Выход флуоресценции, с биОлОГнческими Объектами. В частно" сти, О~мечается, что йспользованйе таких красителей во флуоресцеитиОЙ спектроскопии позволяет получать данные как 1П нчз, так и при работе с Тк~нями биологического материла, В другом Варйайте — заменяюшймй его модельнымн системамн. Глава 2 посвяшена йзложению методйкй зксперимейта. Произведено Описание пробоподготовки растворов альбуминов 1б~ рц,его и человечьего) с молекулярными маркерами Органйческйх красителей семеЙства флуоресцеина.

Подробно излагается процедура измерения спектров поглощения и определения степени молекулярной ассоциации, равно как и ряда конфигурационных параметров системы, Обсуждаются особенности измерения спектрально-люминесцеитных характеристик окрашенных растворов и маркированньгх бел~~~, В Главе 3 представлены результаты исследования. Приведены спектральные характеристики флуОресценции растВоров маркированных альбумнной, а Также Данны~ по тушенйю флуоресценции, ВКЛЮЧая й концентрационное тушение.

Кроме того, здесь же приведены результаты исследоваййя процессов молскулярйОЙ ассоциаций марке1юв флуо1зесцеийового ряда й белковык растворах, Зайершается Глава изложением результатов по изучению пронессов Вращательной Лиффузин люмннесиентных молекулярнь»х меток В растворах сывороточнь»х альбуминов, Таким об1»азом, зкспернментальное исследование сзруктурных и динамических СВОЙСТВ Молекулярных л»оминеспентных зондов, ассопиироВанных со структурами различных сь»вороточных альбуминов в Водных растворах различнОЙ кислОтности, Осуществленное В лнссертапионнОЙ ра" боте Кулеп»овой А.А, является завершенной научной работой, автору которои удалось найти решение Всех пОставлениых В диссертапни залач, Использование спектрально-люминеспентнь»х методов лля изучения структуры белковых нанокластеров н молекулярной динамики флуореспентных зОндоВ в них для решения залач лиссертапионного исследования следует признать успешным, учитьп»ая, что основнымн задачамн В перечне очерчеиных диссертантом проолем яВлялись структурно-динамические залачи.

Следует Отметить, что Столь Летализирйванные сВОЙства исслеЛованных пробиологических ианОсистем не мОГли бьггь Выявлены без привлечениЯ сОВремеинОЙ спектроскопической метололОГии и сООтветстВуюшеГО еи Высокотехнологичного лабораторного инструментария, Для интерпретайии наблюлаемых ЗависимостеЙ ме»клу Оптическими спектрами и характерными параметрамн белковых наносистем автором привлекались ОснОВные пОло»кения теории тушения люминеспеипии молекул В конденсированных средах, тео1»ии Вращательной и конпентрапноиной деполяризапин люминеспенпин, а так»ке ИОВ~ЙШие дости»кения В ОбЛасти физики белков, молекулярноЙ Оптики н физики днсперсньгх Систем.

Изло»кенные В диссертации результаты мОлекулярнОГО конфОрмапи- ОннОГО анализа суШестВенно дополняют имеюшиеся литературные данные о структуре б~лковых кластеров и пропессах образования молекулярных ассониатов Органических красителей в растворах сыво1»оточных альбуминов. Обнару»кеннь»е автором лиссертапии Особенности Вкл»очения молекулярных зондов В белко~ы~ структуры Водных растворов 1»азличной Кислот- ности могут найти применение при разработке лекарственнь»х препаратов в гематологии, новых методов люминеспентного мониторинга в молекулярнои биологии и протеомике, а так»ке В различных Областях фармакологии и медипииы. Автора диссертапионноЙ работы Отлича»от Оригиналь»юсть постановки ряда рассмозренных В диссертапии экспериментальных задач, выбор адекватных н наиболее оптимальных спекгрально-оптических методов измерении характерных параметров белковых наноструктур, а так»ке использование взаимно дополняя»шнх сочетаний абсорбпионных и полярн- запиОИИО-люмииеспентных спОсОбОВ исслелОВания строения налмОлекуляриых структур и динамики молекулярнь|х 3ОндОВ.

К нелостаткам 1»аботы мо»кно Отнести использование не~колько неоднозначного термина кнаномаркер», не вызывающего нареканий В широком смысле, но приводящего к разночтениям, поск~льку долгие годь», аплот~ до настоящего времени, сам низкомолекулярный зонд не было при- йято относйть к нанообьектам, хотя такйм Об'ьектом й является сама зой- лйруемаЯ система «маркер — белкоВый йанокластер».