Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования, страница 5

et al.// Blood.—1995.—v.86.—p.989–1000.24Leitzel K. et al.// Cancer Res.— 1991.—v.51.—p.4149–4154.2320рался супернатант от предыдущего. Приготовленные образцы обедненной тромбоцитами плазмы хранились при –18°C.Формирование фибриновых сгустков. Пробирки с плазмой размораживались вводяной бане при 10°C. Образцы по 0,25 мл плазмы отбиралось для каждогоэксперимента по коагуляции в стандартную 2 мл пластиковую пробирку фирмыЭппендорф. К образцам добавлялось 3 мкл 0,2 M CaCl2 (конечная концентрациядобавленного CaCl2 в растворе составляла 2,5 мМ) с последующим интенсивнымперемешиванием.

Сразу после этого добавлялся тромбин в количестве 2 NIH U/мл.Использованный тромбин был приобретен в SIGMA (T6884, из человеческойплазмы). Процесс коагуляции производился при 27°C в течение 3 часов длянормальной плазмы и 6 часов для плазмы типа Марбург. В итоге получался зрелыймакроскопический сгусток, пригодный для последующей обработки. Реакцияпрекращалась путем замещения буферного раствора на 2 % раствор глютаральдегида в фосфатном буфере (pH 7,3, Merck) c 1 % сахарозы 25 .

Опыт показал, что вотсутствие дополнительного Ca++ сгустки фибрина Марбург не обладали необходимой механической прочностью и разрушались при дальнейших манипуляциях.Сканирующая электронная микроскопия. Сгустки тщательно промывались в стандартном PBS буфере, затем дегидратировались путем перенесения в растворы с увеличивающимися концентрациями этанола (20%, 40%, 60%, 80%, 100%). После этого сгусткипросушивались методом критической точки26 .

Высушенные сгустки приклеивались кдержателю образцов с помощью проводящей пасты Leit-C (G3300, Plano GmbH) иподвергались покрытию 3 нм слоем платины и углерода методом испарения электронным пучком. Образцы исследовались в микроскопе Hitachi S-5200, детектированиеизображений производилось по вторичному электронному сигналу.Статистическая обработка изображений. Измерения характерных размеров наСЭМ-микрографиях производились с помощью графического редактора GIMP. Статистические распределения толщины фибров для нормального и мутантного сгустков былиполучены из серий по 4 микрографии каждого.

Диаметры фибрилл нормального фибринаизмерялись по латеральному узору микроструктуры на фибрах (Рис. 6). На микрографиях мутантного ф.-п. сгустка видны нити, напоминающие четки (Рис. 6). Поэтому2526Reimer L. et al.—Berlin:Springer-Verlag,1977.— 282S.Anderson T.F.// Trans NY Acad Sci.—1951.—v.13.—p.130–134.21толщины этих нитей рассчитывались, как среднее на основании измерений в соседнихточках. Средние значения и их стандартные отклонения (указываются после знака «±»)были рассчитаны для каждого распределения.

Гистограммы распределений былипостроены с помощью Microsoft Excel (Рис. 7).Рис. 6. Слева — СЭМ-микрофотографии высокого разрешения фибринового сгустка мутантного фибрина типаМарбург (А) и нормальных плазменных тромбов (Б),полученные автором. Длина масштабных отрезковсоставляет 250 нм. Обращает на себя внимание микроструктура фибра нормального фибрина (Б), указывающаяна фибрильную субструктуру. Сверху — СЭМмикрофотографии фибрина Марбург из литературы. Длинамасштабных отрезков — 1 мкм.Результаты и обсуждение. СЭМ микрографии высокого разрешения нормальногоф.-п. сгустка и сгустка фибрина типа Марбург представлены на рис. 6.

Различия междуними легко заметны. Они проявляются в толщине фибров, образующих фибриновыесети. Полученные СЭМ микрографии обладают разрешением достаточным, чтобы различать в образцах ф.-п. сгустка упакованные вфибр отдельные фибриллы, проявляющиесякак элементы микроструктуры (Рис. 6 Б).Распределение толщин фибров, измеренныхдляобразцовф.-п.сгусткамутантногофибрина представлено на рис.

7 А (среднийРис. 7. Распределение толщин фибров длямутантного плазменного сгустка (А) инормального (Б). Распределение A (среднеезначение толщин фибров 20 ± 2,0 нм, n = 35)Распределение толщин фибров нормальногоплазменного тромба показано на Б (средняятолщина 0,18 ± 0,048 мкм, n = 169, соответствует литературным данным).размер равен 20 ± 2,0 нм). Толщина фибрилл вфибрах нормального плазменного сгусткаравна 21 ± 2,4 нм.

Средняя толщина фибровнормального ф.-п. сгустка 0,18 ± 0,048 мкм. Изчего следует, что каждый фибр в нормесодержит в среднем 64 фибриллы. Толщины22единичных фибрилл, полученные по периоду латеральных микроструктур на фибрах(20 ± 2,0 нм), согласуются с литературными данными (19 нм)27 .Очевидно, что «бесфибровая» структура сгустка фибрина типа Марбург будет влиять наих макроскопические свойства, такие как механическая прочность, модули упругости,проницаемость и т.д. Оценка соотношение проницаемостей нормального ф.-п. сгустка имутантного дает kfpM kfp ∼ lfp lfpM ≈ 2 ⋅10-2 . В то же время, «тонкая» структура ф.-п.сетки мутантного фибрина Марбург не будет оказывать влияние на коэффициентыброуновской диффузии для большинства факторов свертывания и лизиса согласнопроведенным оценкам.ЗаключениеВ заключении автор обобщает полученные результаты.

Оценки автора показали, чтокоэффициент проницаемости Дарси ф.-п. сгустка зависит от суммарной длины фибров вединице объема. Экспериментально полученная проницаемость ф.-п. сгустка, сформированного из плазмы, содержащей 3,8 мг/мл фибриногена, оказалась равна 3±1 дарси, чтонаходится в согласии с литературными данными и оценками автора. Таким образом,закон Дарси адекватно описывает фильтрационные потоки в ф.-п.

сгустках. Макроскопическая скорость потока через ф.-п. сгусток составляла V < 4,1⋅10–1 см/мин, а макроскопический сдвиг γmax≈ 3,1⋅10–1 ÷ 2,9 мин–1. Этот сдвиг примерно соответствует диапазону,при котором в модели, представленной в главе 2, наблюдалась сильная зависимостьсценария эволюции запороговогого возмущения от пристеночной скорости сдвига(γmax≈ 2,6⋅10–1 ÷ 8,9 мин–1). Следовательно, эволюция любого запорогового возмуще-ния, находящегося внутри ф.-п. сгустка может быть адекватно описана только с учетомфильтрационных потоков. Очевидно также, что сценарии образования сгустков будутзависеть от величины параметра ψ c из-за большой чувствительности к сдвигу, а значит ик полю скоростей потока.

Экспериментально показано, что свойства ф.-п. сеток, вчастности, проницаемость, сильно зависят от особенностей процесса полимеризации.Следовательно, любая модель, претендующая на хорошее количественное соответствие сэкспериментом, должна учитывать особенности полимеризации фибрина, чтобыкорректно рассчитывать локальную длину фибров в единице объема.27Weisel J.W.// J Ultrastruct Mol Struct Res.—1986.—v.96.—p.176–18823Результаты и выводы1. Экспериментально показано, что альбумин не накапливается на сформированной фибрин-полимерной сетке в количествах, сопоставимых с массой самогофибрина.2. Показано, что для описания движения жидкости c малыми скоростями(<1см/сек) внутри фибрин-полимерного сгустка справедлив эмпирический закон Дарси.

Выполненные в рамках представления о микровязкости расчетыавтора совпадают с экспериментальными данными, полученными автором. Количественное согласие расчетных и экспериментальных данных указывает назависимость проницаемости фибрин-полимерного сгустка от суммарной длиныфибров в единице объема. Анализ литературных данных и результаты автора поисследованию мутантного фибрина Марбург методами электронной микроскопии позволяют заключить, что суммарная длина фибров сгустка может варьироваться в широких пределах, как и его проницаемость.3.

Проведенные с участием автора расчеты по двухавтоволновой модели показали,что запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей сдвигажидкости ( γmax< 8,9 мин–1), соответствующего параметрам течений внутрифибрин-полимерного сгустка ( γmax≈ 3,1⋅10–1 ÷ 2,9 мин–1), а не в просвете сосуда.4. Для построения количественной модели плазменного звена гемостаза и эволюции фибрин-полимерного сгустка в сдвиговом потоке необходимо использоватьописание полимеризации фибрина, учитывающее длину фибров в единице объема. Это сделает возможным рассчитывать проницаемость сгустка.24ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Чуличков А.Л., Николаев А.В., Лобанов А.И., Гурия Г.Т.

Пороговая активациясвертывания крови и рост тромба в условиях кровотока // Математическое моделирование.— 2000, Т.12, №3, стр. 75-96.2. Николаев А.В., Синауридзе Е.И., Буравцев В.Н. Экспериментальное наблюдение проницаемости фибринового тромба // Вестник Московского университета.— Сер. Физика и астрономия 2009, №3, стр. 85-89.3. Николаев А.В. , Вальтер П., Эгбринг Р., Гурия Г. Т. Тромбы из плазмы доноровс гиподисфибриногенемией Марбург не обладают фибровой структурой //Тромбоз Гемостаз и Реология.— 2004, Т.1, №17, стр.

30-36.4. Куриленко И.А., Лобанов А.И., Николаев А.В. Качественное исследованиематематической модели свертывания крови в сдвиговом потоке // МатериалыМеждународной научной конференции «Моделирование нелинейных процессови систем», Москва, 2009 г., стр. 515–529.5. Николаев А.В., Лобанов А.И. Применение метода потоков при численномисследовании структурообразования в реакционно–диффузионной возбудимой2D-системе с активным восстановлением // Тез. докл.

Международной конференции “Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах”, Москва – Суздаль, 12 – 18 июня 19956. Николаев А.В., Ковалев Ю.С., Горделий В.И. Исследование структурныхсвойств фибрин-полимерных сетей методом малоуглового рассеяния нейтронов// Сборник трудов XLVIII конференции МФТИ, cекция биофизики и физикиживых систем, 2005 г., МФТИ, стр. 145–149.25Николаев Андрей ВладимировичФибрин-полимерные сетки, математическоемоделирование и экспериментальные исследованияПодписано в печать 16.09.09Формат 60х84 Усл. печ.л.1,2Тираж экз.

80 Заказ 33Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-технический институт(государственный университет)141700, Московская область г. Долгопрудный, Институтский пер. 926.