Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования (1105058), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В результате в колонке формировался фибриновый сгусток высотой примерно 8 см. Сгусток выдерживали в колонке 3–4 часапосле начала процесса коагуляции. После полного свертывания плазмы пленкупарафильм удаляли и систему использовали подобно хроматографической колонке(Рис.
3). Перед началом эксперимента сгусток промывали 6–8 мл буфера. Высотустолбабуферанадверхнейграницейсгусткаподдерживалипостоянной(L = 10 ± 0,5 см) с помощью перистальтического насоса. Суммарная высота сгустка ираствора над ним составляла hp = 18 см. В пробах элюата определялся белок. Послепромывки сгустка 5 млРис.
3. Схема установки для проведенияэкспериментов по определению проницаемости фибриновых сгустков: 1 —стеклянная трубка (внутренний диаметр5,6 мм); 2 — сформированный сгусток(объем 2 мл, высота hc = 8 см); 3 —капроноваясетка,поддерживающаясгусток; 4 — резервуар для сбора проб; 5 —резервуар с буфером для промываниясгустка; 6 — перистальтический насос,поддерживающийпостояннуювысотустолба буфера со сгустком в колонке7–силиконовая(hp = 18 ± 0,5 см);магистраль внутренним диаметром 1 мм.буфера общий белок вэлюате составлял менее 0,1 мг/мл.Отмы-тые сгустки использовали в экспериментахпо измерению их проницаемости или сорбции на них альбуминаиз растворов.Определение массы фибриновых сгустков.
В отдельных экспериментах былаопределена масса сформированных и промытых фибриновых сгустков. Для этогосгустки (в объеме 2 мл вместе с объемом окружающего буфера) были перенесеныв 2 мл раствора 0,4 М NaOH и растворялись в течение 12 часов при 37 °С. Вполученном растворе была измерена концентрация белка, после чего была рассчитана общая масса белка в растворенном сгустке.Измерение проницаемости фибриновых сгустков.
Для измерения проницаемостифибриновых сгустков, ф.-п. сгустки, промытые буферным раствором, использовались как неподвижная фаза хроматографической колонки. По 0,1 мл растворов 5%альбумина или 1% гемоглобина, а также 1% раствора низкомолекулярногоL-динитрофенилаланина, использованного как маркер хроматографического фронта, вбуфере наносили шприцем с длинной иглой непосредственно на верхнюю границу17сгустка (Рис. 4 A). О проницаемости сгустка судили по скорости прохождения черезнего нанесенного вещества.
Фильтрация окрашенного белка, например, гемоглобина,удобна для визуального наблюдения. Если в сгустке присутствуют какие-либо дефекты,то это становится заметно по изменению формы прокрашенной зоны и такиесгустки выбраковывались. Для оценки взаимодействия подвижной и неподвижнойфаз использовали зависимость положения фронта нанесенного белка от объемапрошедшего элюата.
При этом положение полосы нанесенного белка в ф.-п. определяли по центру — «ядру» полосы, т.к. полосы могут деформироваться, в первуюочередь, из-за пристеночных эффектов. На рис. 4 приведены последовательныефотографии колонки с нанесенным на нее раствором гемоглобина. Cкорости элюциисоставляли от 0,011 до 0,1 мл/мин (Vmax ≈ 4,4⋅10–2 ÷ 4,1⋅10–1 см/мин, макроскопическийсдвиг γmax≈ 3,1⋅10–1 ÷ 2,9 мин–1 ). Падение скорости элюции было обусловленоформированием уплотнения на верхней незакрепленной границе сгустка.
Элюатсобирался каплями в пробирки Eppendorf.Изучение связывания альбумина с отмытыми фибрин-полимерными сгустками. Котмытым сгусткам объемом 2 мл (вместе сокружающим буфером) добавляли по 2 мл5 %-ногораствораальбумина.Такимобразом, конечная концентрация альбуминасоставляла 2,5 % (или 25 мг/мл), а количестРис. 4. Фотографии колонки с нанесенным насгусток раствором 0,1%-ного гемоглобина(0,1 мл) в различные моменты после началаэлюции. Положения «ядра» полосы отмеченычерными треугольниками и соответствуютпрохождению 0; 0,4; 1,4 и 1,55 мл элюата дляслучаев А, В, С и D, соответственно.во ф.-п. в 4 мл суммарного объема былоравно 7,7 мг, учитывая, что измеренная массаф.-п.сгустковсоставляла3,85 мг/мл.Растворы аккуратно перемешивали в течение15 мин так, чтобы избежать полного коллапса сгустков.
После перемешивания сгусткивыдерживали при температуре 20–27 °С в течение разного времени (от 6 до 24 часов). Вопределенный момент времени из каждого образца отбирали по 3 пробы для определения концентрации оставшегося в объеме альбумина.Результаты. Определение массы ф.-п. сгустков показало, что концентрация белка(фибрина) в них составляла 3,85 ± 0,08 мг/мл (n = 3). Это находится в хорошем соответствии с разностью величин концентраций общего белка в исходной плазме (74 ± 3 мг/мл) исуммарным количеством белка, оказавшегося в элюате в ходе промывки (70 ± 3 мг/мл).18В экспериментах по адсорбции альбумина промытые ф.-п. сгустки экспонировались врастворе белка 6, 18 или 24 часа.
Результаты показали, что для каждого из исследованных времен экспозиции,усредненная из 3 независимых измерений концентрацияобщего, оставшегося в растворе белка, соответствовала 25 ± 1 мг/мл. С одной стороны,это говорит о том, что равновесие адсорбции устанавливается гораздо быстрее 6 часов, ас другой — что масса связанного альбумина гораздо меньше общей массы фибрина, вотмытом сгустке (7,7 ± 0,16 мг из оценки выше).Для измерения проницаемости отмытых ф.-п.
сгустков, на колонку со сгусткомнаносили 0,1 мл раствора 5% альбумина или 1% гемоглобина, или низкомолекулярногоL-динитрофенилаланина и следили за скоростью прохождения полосы нанесенноговещества при смывании буфернымраствором. Несмотря на то, что внекоторой части опытов фибриновыйсгустокдлительногопомешалоневыдерживалпромывания,набратьчтохорошуюстатистику, в тех случаях, когдаL-динитрофенилаланин и гемоглобин демонстрировали равномерноеРис. 5.
Концентрации человеческого альбумина в пробах,элюированных с колонки с отмытым предварительнофибриновым сгустком, в зависимости от объема прошедшего элюата. На колонку было нанесено 0,12 ± 0,1 млраствора альбумина с концентрацией 50 мг/мл.движениепоколонке,былиполучены очень схожие зависимости объема прошедшего элюата отвремени.Длявсехобразцовконстанты Дарси ( kfp ), рассчитанные для начального этапа фильтрации, лежали вдиапазоне 3 ± 1 дарси, что совпадает с приведенными в литературе данными21 и оценочным расчетом.Поскольку скорость фильтрации через ф.-п.
сгусток в ходе опыта изменялась, то дляхарактеристики проницаемости была использована зависимость положения полосывещества (в см от верхней границы сгустка) от объема прошедшего элюата (в см3). Этизависимости для гемоглобина и L-динитрофенилаланина были линейны, а тангенсыуглов наклона оказались одинаковы (–3,9 ± 0,1 см/мл для бычьего гемоглобина и –4,1 ± 0,1 см/мл для L-динитрофенилаланина). За скоростью фильтрации альбумина21Diamond S.L.// Annual Review of Biomedical Engineering.—1999.—v.1.—p.427–461.19можно следить, измеряя концентрацию прошедшего белка в пробах элюата.
На рис. 5приведен график зависимости концентрации альбумина от объема прошедшего элюата водном из экспериментов. Центр пятна альбумина в данном случае вышел примерно наобъеме 2 мл. Это позволяет положить, что тангенс угла наклона прямой зависимостиположения «ядра» полосы от объема элюата для альбумина примерно равен таковым длягемоглобина и L-динитрофенилаланина.
Полный интеграл массы альбумина подграфиком равен 5,14 мг. Наблюдаемый концентрационный хвост (Рис. 5) можно объяснить деформациями полосы из-за пристеночных эффектов, схожими с теми, что быливидны ранее при фильтрации гемоглобина (Рис. 4).СЭМ сгустков из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург.Известно более 300 генетических мутаций фибриногена. Структура мутантныхформ ф.-п. может сильно отличается от нормальной, особенно в случае гомозиготныхмутаций.
Мутация фибриногена Marburg была впервые обнаружена в 1975 году22 . Этамутантная форма примечательна тем, что у нее нарушена латеральная агрегация фибрилл23 . Следовательно, ф.-п. сгустки фибрина Marburg должны обладать наибольшейвозможной удельной длиной фибров.СЭМ широко применяется для исследования структурных особенностей ф.-п. сеток,полученных из нормального фибрина и его мутантных форм. Прочность, реологическиеи динамические параметры макроскопических сгустков определяются статистическимисвойствами ф.-п.
сеток. Для определения этих свойств анализ СЭМ-микрографий даетбольшие возможности.Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы получить микрографиивысокого разрешения зрелых ф.-п. сгустков фибрина Marburg и сравнить их структуру соструктурой нормальных сгустков.Приготовление образцов плазмы. К девяти объемам цельной крови добавлялсяодин объем 3,8% раствора цитрата натрия. Тромбоциты вместе с другими клеткамикрови были удалены путем центрифугирования в 4 приема: 2 раза по 15 мин на200 g и два раза по 20 мин на 5000 g 24 . Центрифугирование образцов производилось при температуре 4°C, для каждого последующего центрифугирования отби-22Fuchs G. et al.// Blut.—1977.—v.34.—p.107–118.Sobel J.H.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
