Диссертация (Статистическая теория структуры хроматина), страница 4

Интересно, что подобная территориальная организация характерна длярасплава незацепленных полимерных колец [53].16Рис. 1.4. Территориальная организация интерфазных хромосом в ядре человеческойклетки. Изображение получено с использованием метода флуоресцентной гибридизацииFISH.

Изображение заимствовано из работы [27].1.1.2.3. Объемная структура отдельных хромосомНесмотря на огромный вклад метода флуоресцентной гибридизации в пониманиеглобальной внутриядерной организации, вопрос о внутренней структуре отдельно взятыххромосом по-прежнему оставался открытым. Прогресс в этой области был достигнутблагодаря развитию методик конформационного захвата хромосом, подробно описанныхв разделе 1.1.2.1.2 [19,29]. Суть метода заключается в лигировании локализованных впространствеучастковпоследовательногохромосомыдобавлениявспециальныхкольцевыемолекулымолекулярныхпосредствомкомплексов.Анализпродуктов сшивания дает возможность численно охарактеризовать пространственнуюблизость конкретных регионов генома.

Стоит отметить, что подобного рода информацияможет быть полезна не только для понимания пространственной архитектуры хроматина,но и для построения сети взаимодействий внутри генома. Фактически, методика далавозможностьанализироватьчастоту контакта двухотдельно взятыхрегионовмакромолекулы.17Методыконформационногозахватахромосомдаливозможностьэкспериментально наблюдать формирование крупных петель, способствующих дальнимконтактам, например, в рамках взаимодействия энхансера и промотора. Энхансер – этоучасток молекулы ДНК, содержащий сайты связывания с факторами транскрипции(специфическими белками, регулирующими транскрипцию генов), служащий дляувеличения уровня экспрессии гена или группы генов.

Интересная особенность данногорегуляторного механизма заключается в том, что, несмотря на необходимостьпространственной локализации энхансера и промотора (участка ДНК, находящегосяперед кодирующей частью гена), требующейся для инициации процесса транскрипции,относительное расположение этих элементов вдоль макромолекулы может быть весьмадистанцированным (несколько сотен килобаз) [1]. В работе [7] с использованием 5Cметода захвата хромосомной конформации для генома человека были зафиксированыпространственные контакты промоторов более чем с 1000 сайтов ДНК, включающихэнхансеры и инсуляторные элементы, при этом расстояние вдоль по цепи между нимидостигало сотни килобаз. Подобные исследования позволяют сделать вывод о том, чтоорганизация хроматина способствует диффузионному поиску сильно удаленныххромосомных регионов.Наиболее полную картину пространственной архитектуры хромосом удалосьполучить благодаря модификации метода хромосомного захвата Hi-C.

Методикапозволяет построить двумерную матрицу контактов пар хромосомных локусов в клетке,находящейся в естественных условиях. Матрица строится таким образом, что индексыстрок и столбцов представляют из себя участки хромосомы, пронумерованные в порядкеихследованиявдольпоцепи.Этоможносделать,знаянуклеотиднуюпоследовательность конкретной макромолекулы. Каждая ячейка матрицы, например, синдексами i и j, содержит численное значение вероятности пространственного контактаучастков хромосомы с номерами, соответственно, i и j. Для получения вероятностиконтакта двух регионов цепи – строится пул бинарных матриц контактов для целойклеточной популяции, где каждый из элементов принимает значение 1 – если в рамкахконкретной реализации упаковки участки макромолекулы были лигированы и 0 – еслилигирования выбранных участков не произошло.

Проводя усреднение полученногонабораматрицвнутри-цепныхконтактов,получаютсядвумерныепрофили,количественно демонстрирующие частоту контактов двух участков хромосомы, что приусреднении по ансамблю эквивалентно вероятности контактов между звеньямиполимерной цепи, как показано на Рис.

1.5. Матрица при этом оказывается18симметричной, а произвольно взятая строка или столбец показывают профильвероятности контакта выбранного региона с остальными сегментами молекулы.Рис. 1.5. Матрицы внутрицепных контактов в человеческих хромосомах: (а) 3хромосома и (б) 7 хромосома (данные по статистике внутри-цепных контактовпредоставлены М.

Имакаевым). Разрешение матрицы 40 Кб. Цветовой спектриллюстрирует вероятность контакта хромосомных регионов, логарифмическименяющуюся от темно синего (регионы с нулевой вероятностью контакта) к яркокрасному (регионы, находящиеся в постоянном контакте).Анализматрицконтактовпозволяетсделатькачественныевыводыопространственной организации хроматина в рамках конкретной клеточной популяции, атакже получить численную оценку вероятности контактов отдельно взятых регионов, какв рамках одной хромосомы [29], так и для комплекса хромосом организма [54].Экспериментальные матрицы контактов (примеры матриц контактов приведенына Рис. 1.5) обладают набором структурных особенностей в широком диапазонемасштабов: 1) матрица каждой отдельно взятой хромосомы имеет некоторуювнутреннюю структуру, это говорит о том, что конденсация в рамках каждоймакромолекулы происходит не случайным образом, а с некоторой точностьюконсервативна для клеток выбранной популяции.

В противном случае двумерныйпрофиль вероятности контактов имел бы градиентный спад цвета при удалении отглавной диагонали; 2) области с высокой вероятностью контакта резко сменяютсяобластями, в которых контакты относительно редки; 3) вдоль главной диагоналипросматриваются элементы иерархической структуры, что говорит о вложенностидоменов друг в друга. Помимо качественных характеристик, метод Hi-C позволяетоценить важную статистическую характеристику структуры – зависимость вероятности19контакта P от расстояния между сегментами молекулы вдоль по цепи, n. Было показано,что в широком диапазоне масштабов (от 1 до 10 мегабаз2) наблюдается следующий законуменьшения вероятности контакта P(n) ~ 1/n [29]. С точки зрения полимерной теории,наиболее подходящей структурой для описания наблюдаемого результата оказалосьсостояние складчатой глобулы3 [13].

Идея использовать складчатую глобулу дляописания хроматина впервые появляется в работе [11]. Основным аргументом,позволившим сделать подобное допущение, была незаузленность состояния складчатойглобулы. Более подробно статистические и структурные особенности складчатойглобулы, как состояния полимерной цепи, будут обсуждены в разделе 1.2.2.Важно отметить, что результаты, полученные в Hi-C экспериментах, успешносогласуются с результатами флуоресцентной гибридизации.

Действительно, численноемоделирование расплава незацепленных полимерных колец показало, что с однойстороны, кольца организуются в непрекрывающиеся блобы, подобные хромосомнымтерриториям; с другой, статистические характеристики каждого отдельно взятогополимерного кольца близки к характеристикам складчатой глобулы [10,53]. Методконформационного захвата также был использован для получения информации опространственной организации генома в клетках прокариот [55,56], однако, структураполученных карт внутрицепных контактов позволяет сделать вывод о том, чтофрактальная упаковка не характерна для молекул ДНК в бактериях. Вероятно, этосвязано с низкой плотность упаковки генетического материала прокариот.1.1.3.

Динамика хроматинаПрименение флуоресцентных маркеров не ограничилось получением статическихпредставлений о пространственной структуре эукариотического генома, использованиефлуоресцентного микроскопа дало возможность следить за динамикой сегментов ДНК.Дляэкспериментальнойоценкивнутриядернойдиффузиииспользовалисьфлуоресцентные зонды, синтезированные для маркировки теломер [34,57]. Теломеры –это концевые участки эукариотических хромосом, необходимых для поддержанияцелостности и стабильности макромолекулы.

Благодаря повторяющейся нуклеиновойпоследовательности теломер, зонды, направленные на связку с повторяющимсяэлементом этой последовательности, осуществляют маркировку молекулы с высокойэффективностью.23мегабаза (Мб) – единица измерения длины нуклеиновых кислот, равная 1 млн. нуклеотидных парскладчатая глобула – в литературе также упоминается как фрактальная глобула20Подробно диффузия теломер в живых человеческих клетках была изучена вработе [34]. Были показаны различные режимы диффузионного движения в широкомвременном диапазоне, от 10–2 до 10 4 секунд.

Маркировка теломер происходила такимобразом, что на каждую клетку приходилось порядка 60 флуоресцирующих меток. Накоротких временных масштабах (от 10–2 до 100 секунд) наблюдалось аномальноедиффузионное движение маркеров со скейлинговой экспонентой 0.4 +/- 0.04, котороепереходило в режим нормальной диффузии за временные интервалы порядка 102 секунд.Важно отметить, что диффузионный режим движения, зафиксированный на малыхвременных масштабах, не соответствует современным представлениям о рептационномдвижениивнутриравновесногоглобулярногосостоянияполимера,котороепредсказывает поведение среднего квадрата смещения звена <r2> = t 1/4.Аномальная диффузия может объясняться обилием топоизомераз, специальногокласса ферментов, влияющих на топологию цепи ДНК. Существует несколькомеханизмов действия топоизомераз: ферменты первого типа (топоизомераза I) изменяютсуперспирализацию полимера, внося одноцепочечные разрывы в спираль ДНК, беззатраты АТФ; ферменты второго типа (топоизомераза II) – инициируют АТФ-зависимыедвуцепочечные разрывы молекулы, позволяя нитям ДНК проходить друг через друга [1].Активность топоизомераз второго типа может способствовать смене диффузионногорежима сегментов цепи ДНК.

Однако, в рамках текущей работы, мы продемонстрируем,что природа наблюдаемого режима диффузионного движения хорошо согласуется сгипотезой об упаковке хроматина в структуру складчатой глобулы, и может объяснятьсябез введения в модель упаковки специфических взаимодействий.211.1.4. ВыводыТаким образом, современные экспериментальные методы продемонстрировалиследующий набор особенностей упаковки хроматина в ядрах эукариотических клеток:хромосомы упакованы компактно (не в плане абсолютной плотности, а вструктурном смысле)хроматин организован территориально (каждая хромосома занимает свойнеперекрывающийся пространственный регион)структура отдельно взятых хромосом:o содержит иерархически организованные доменыo незаузлена (отдельные сегменты цепи деконденсируются от общейглобулярной структуры, формируя петли)o статистика для вероятности внутри-цепных контактов имеет вид P(n) ~ 1/nаномальнаядиффузиямаркированныхсегментовцепиДНК–режимдиффузионного движения отличен от режима, описываемого рептационойтеорией для равновесного глобулярного состояния полимерной цепи.Базируясь на перечисленных наблюдениях, наиболее удачной моделью для описанияорганизации хроматина в эукариотическом ядре оказалась складчатая глобула.Действительно, равновесное глобулярное состояние полимера по своим характеристикамимеетсущественные отличия отособенностейнаблюдаемойэкспериментальноструктуры, в то время как статистические характеристики складчатой глобулы удачноописывают результаты рассмотренных экспериментальных исследований.221.2.

Состояния полимерной цепиИсследованиявобластимолекулярнойбиологиинеизменносвязанысиспользованием физических теорий и моделей. Интерес к физике переходов междусостояниями макромолекул был инициирован как раз по биологическим причинам.Предполагалось, что процесс денатурации белков в живых клетках может быть описанчерез переход клубок-глобула. Изучение структурных свойств хроматина, также, яркоетому подтверждение. Действительно, благодаря размеру молекулы ДНК, имеющей ввытянутом состоянии размер порядка нескольких метров при персистентной длине около50 нм (150 нуклеотидных пар), можно рассматривать молекулу как гибкий полимер, всостав которого входит порядка 20 млн мономерных звеньев.

Принимая во вниманиеналичие упомянутых в предыдущем разделе специфических ДНК-связных белков, можнос хорошей точностью описывать молекулу как свободно сочлененную цепь сисключенным объемом из, порядка, 1 млн мономеров. В текущем разделе будутрассмотрены известные на данный момент конформации полимерной цепи, обсужденыих свойства и методы получения как в реальной жизни, так и в компьютерномэксперименте.