Диссертация (1104904), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Современные представления о внутриядерной архитектуреТекущие представления о пространственной архитектуре хроматина на крупныхмасштабах базируются, главным образом, на результатах FISH и Hi-C экспериментов.Количественные характеристики структур, полученные при применении данных методовк геномам человеческих клеток, показали неожиданные результаты, оказалось, чтохромосомыпостатистическимсвойствамблизкиксостояниюскладчатой(фрактальной) глобулы, метастабильной конформации полимерной цепи.

Болееподробно его особенности будут раскрыты в разделе 1.2. В рамках текущего разделабудет проведен обзор современных методов исследования объемной структуры генома,1килобаза (Кб) – единица измерения длины нуклеиновых кислот, равная 1 тыс. нуклеотидных пар11будут приведены результаты применения этих методов к эукариотическим хромосомам,а также описаны основные гипотезы, предложенные на основе данных результатах.1.1.2.1. Экспериментальные методы исследования внутриядерной организации1.1.2.1.1. Метод флуоресцентной гибридизации (FISH)Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) применяется для маркировкиотдельных локусов с целью наблюдения за их собственной пространственнойлокализацией или перемещениями друг относительно друга [45].

Впервые методиспользовался в биомедицинских исследованиях в начале 80ых годов с цельюобнаружения специфических сегментов ДНК на хромосомах [46]. Процесс подготовкихромосомы к исследованию описан на Рис. 1.2 и состоит из следующих стадий:1) синтез ДНК-проб (флуоресцирующих меток), представлен на Рис.

1.2а - Рис. 1.2в;2) маркировка хромосом, представлена на Рис. 1.2г - Рис. 1.2д.Рис. 1.2. Процесс маркировки хромосом флуоресцирующими элементами. На рисункеизображены 5 стадий процесса: (а) синтез двуцепочечных ДНК-проб, подходящих длясвязывания с конкретными хромосомными регионами; (б) лигирование флуоресцирующихэлементов и ДНК проб; (в) разделение компилименарных оснований в ДНК-пробах; (г)разделение комплиментарных нитей исследуемой макромолекулы; (д) синтезпосредством лигирования флуоресцирующих комплексов и комплиментарных участковмакромолекулы (голубым цветом отмечены нити исследуемой хромосомы; краснымцветом отмечены ДНК-пробы, комплиментарные к последовательностям исследуемойхромосомы; голубыми кружками отмечены молекулы флуорофора).ВметодеиспользуютсяспециальныеДНК-пробы,связывающиесяскомплиментарными мишенями исследуемого образца. ДНК-проба состоит из сегментасвязывания, определяющего локусы, к которым будет присоединяться проба, и12флюорохора.

В результате, за перемещением маркеров можно следить с помощьюфлуоресцентного микроскопа сразу после гибридизации [27,47].FISH метод имеет весомый набор ограничений на спектр применимости: вопервых, он позволяет отследить только отдельно взятые наборы локусов, небольшоеколичество клеток; во-вторых, фотографии, сделанные с его помощью, обладаютневысоким разрешением (дифференцировать пару маркированных локусов возможнотолько если они находятся на расстоянии порядка 105 нуклеотидных пар), чтосущественно усложняет изучение с его помощью организации отдельно взятыххромосом, однако, FISH эксперименты оказались весьма полезными в планедемонстрации глобальной доменной организации генетического материала внутри ядра.1.1.2.1.2. Методы конформационного захвата хромосом (Hi-C)Метод захвата хромосомной конформации применяется для получения данных опространственной близости сегментов макромолекулы.

Метод дает возможностьколичественно оценить вероятность пространственного контакта субцепей исследуемыхобразцов, на основе матрицы внутри-цепных контактов, а также дает представление оборганизации их доменной структуры. Одна из наиболее популярных вариаций методапредставлена на Рис. 1.3.Рис. 1.3. Процесс формирования кольцевых продуктов из ковалентно сшитых соседних впространстве участков ДНК в рамках Hi-C эксперимента. На рисунке приведены тристадии процесса: (а) образование X-образных комплексов при добавленииформальдегидов; (б) расщепление цепи под действием рестрикционных ферментов; (в)внутримолекулярное лигирование.13Существуетнесколькоэкспериментальныхтехникзахватахромосомнойконформации различных по сложности и эффективности:3C (Chromosome Conformation Capture) – метод, позволяющий оценить частотуконтактов между двумя определенными регионами цепи ДНК.

Приготовлениепродуктов для количественного анализа с использованием ПЦР (ПолимеразнойЦепной Реакции) состоит из следующих стадий [29]:1) X-образное сшиваниедобавление формальдегидов, приводящее к сшиванию сегментов одной илинескольких полимерных цепей к белкам за счет образования ковалентных связеймежду аминогруппой белка и нукленовой кислотой; последующая сшивка белковдруг с другом приводит к образованию X-образных комплексов из пространственнолокализированных сегментов ДНК2) фрагментация ДНКрасщепление полимерной цепи на специфические сайты под воздействиемрестрикционных ферментов.

Действие ферментов чувствительно к нуклеотидномусоставу молекулы и приводит к расщеплению молекулы в местах с определеннымнуклеотидным составом, как следствие, одинаковые по нуклеотидному составупоследовательности ДНК расщепляются на одинаковые по размеру сегменты3) внутримолекулярное лигированиесшивание фрагментов ДНК в условиях низкой плотности (для уменьшениявероятности сшивки концов молекул, принадлежащим различным X-образнымкомплексам – концентрацию ДНК предварительно понижают)4) разрушение X-образных комплексовповышение температуры приводит к разрушению белок-белковых связей (Xобразных сшивок), стабилизирующихX-образные комплексы, образованные впроцессе (1)5) обработка результатовдля оценки частоты образования контактов между конкретными сайтами молекулы,лигированные фрагменты ДНК анализируют с помощью ПЦР с участием праймеров,специфичных для двух отдельно взятых локусов. Как результат, данная методикаколичественно характеризует лишь частоту контакта двух заданных напередрегионов молекулы.144C (Circularized Chromosome Conformation Capture) – модификация метода 3C,дающая информацию о контакте конкретного хромосомного локуса со всемиостальными [48,49].

Отличие от 3C метода заключается в повторной фрагментацииДНК, с последующей циклизацией лигированного ДНК комплекса. В результате,праймеры ПЦР специфичны лишь для исследуемого локуса, вне зависимости отфрагмента цепи, с которым он контактирует, что позволяет количественно оценитьконтакты выбранного локуса с любым другим сегментом молекулы при помощитехнологии ДНК-микрочипов.5C (Carbon-Copy Chromosome Conformation Capture) – еще одна вариация метода 3C,позволяющая одновременно анализировать взаимодействие сразу несколькихучастков цепи [19]. Отличие от методики 3C заключается в том, что вместоприменения ПЦР на шаге (5), осуществляется лигирование универсальных праймеровко всем продуктам (4) стадии процесса. Таким образом, любой ДНК комплекс, внезависимости от локусов, входящих в его состав, может быть проанализирован спомощью ДНК-микрочипов за счет сшитого с ним праймер-маркера.

Стоит отметить,что метод оказался неподходящим для построения полной матрицы взаимодействий вхроматине, ввиду того, что для этого бы потребовалоогромного наборспецифических праймеров [50]. Решить данную проблему помогла новая методика,получившая название Hi-C метод.Hi-C – методика была разработана для оценки пространственных контактов по всемугеному [22,29]. Для этого после стадии фрагменации сшитых ДНК-комплексов,осуществленной по аналогии с 3C методом, свободные концы локусов маркируют спомощью биотинилированных нуклеотидов, которые затем закольцовываются врезультателигированияполученныхДНК-комплексоввусловияхнизкойконцентрации.

Затем кольцевые сегменты, делятся таким образом, что биотиновыемаркеры остаются на отрезках молекул, содержащих места сшивки нативныхлокусов.Биотинилированныеучасткиизвлекаютсязасчетиспользованиястрептовидина (имеет высокое сродство к биотину), после чего проводится процедурамассового параллельного секвенирования, позволяющая сделать выводы о частотевнутрицепных контактов во всем геноме.

Процесс проиллюстрирован на Рис. 1.3.151.1.2.2. Территориальная организация хроматинаИдея о доменной организации хромосом в ядре была впервые сформулирована вработе [2] для животных клеток. Термин хромосомные территории был впервыеиспользован в работе [51], в рамках которой описывалась реорганизации хроматина:выводы о позиции хромосом в ядре делались на основе наблюдений за торчащими изобщего сконденсированного состояния концами макромолекул. В рамках [51] авторпоказал, что хромосомы во время интерфазы дифференцированы по объему ядра.Современная экспериментальная методика флуоресцентной гибридизации FISH (методподробно разобран в разделе 1.1.2.1.1) [26] предоставила возможность получить яснуюкартину распределения хроматина внутри ядра посредством маркировки хромосомразличными типами флуорохоров.

Анализ фотографии ядра интерфазной клетки,сделанной с помощью флуоресцентного микроскопа, показал, что хромосомыорганизованывкомпактныеструктуры,локализующиесявотдельныхнеперекрывающихся регионах (снимок приведен на Рис. 1.4) [1,27]. Эти регионыполучили название хромосомных территорий, а подобная организация хроматина,соответственно, была названа территориальной. Локальные особенности каждого издоменов неконсервативны, текущее состояние структуры определяется активностьюДНК-связных белков, которая существенно зависит от типа клетки и стадии ее развития.Вариация структур для клеток разных тканей приводит к регулированию доступностиотдельных локусов, что делает гены доступными к считыванию, или наоборот блокируетих активность [1].Методфлуоресцентнойгибридизацииоказалсяполезендляизучениявнутриядерной динамики.

Наблюдение за реорганизацией отдельно взятых хромосомклетки с помощью метода FISH продемонстрировало, что хромосомные регионы, вотсутствии экспрессии генов, входящих в их состав, находятся в плотно упакованномсостоянии, однако, инициация экспрессии ведет к деконденсации фрагментовмакромолекулы. В периоды генной экспрессии петли хромосом растягиваются, занимаябольший объем и образуя структурные домены малой плотности [52]. Природа данногоявления связана с несколькими факторами, во-первых, деконденсация локуса делает геныболее доступными для считывания; во-вторых, полученные петли могут при практическистатичном состоянии компактной фазы перемещаться в регионы с высокой локальнойконцентрацией ферментов и молекул РНК, ответственных за протекание конкретногопроцесса [1].

Характеристики

Список файлов диссертации