Комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды

На правах рукописиСтарицын Сергей НиколаевичКОМПЛЕМЕНТАРНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ СФОТОПОЛИМЕРИЗУЕМЫМИ ЛЕНГМЮРОВСКИМИ МОНОСЛОЯМИ,СОДЕРЖАЩИМИ НУКЛЕОЛИПИДЫСпециальность 03.00.02 – биофизикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква – 20061РаботавыполненанакафедребиофизикифизическогофакультетаМосковскогогосударственного университета им. М.В. ЛомоносоваНаучный руководитель:доктор физико-математических наук,профессорТвердислов Всеволод АлександровичОфициальные оппоненты:доктор физико-математических наук,профессор Каданцев Василий Николаевичкандидат физико-математических наукСолдатов Евгений СергеевичВедущая организация:Институт молекулярной биологииим.

В.А. Энгельгардта РАНЗащита диссертации состоится«22»июня2006 г. в16ч.на заседаниидиссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им.М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова,физический факультет, аудитория 5-19 .С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультетаМГУ им. ЛомоносоваАвтореферат разослан« 19 »мая2006 г.Ученый секретарьдиссертационного совета К 501.001.08кандидат физико-математических наук, доцентГ.Б.

Хомутов2Общая характеристика работыАктуальность темы исследования. Настоящая работа, посвященнаякомплементарному связыванию нуклеиновых кислот с фотополимеризуемымиленгмюровскимимонослоямиамфифильныхпроизводныхазотистыхоснований (нуклеолипидов) и жирных кислот, направлена на изучение ирешение актуальных проблем биофизики планарных структур, молекулярнойбиологии,медициныиприкладныхзадач:созданиебиосенсоровибиомимикрических поверхностей, разработку новых методов формированиянаноструктур с заданными свойствами.Интерес со стороны молекулярной биологии и медицины в этой области, вчастности, обусловлен тем, что природные и синтетические нуклеиновыекислоты, образовавшие комплекс с амфифильными молекулами, приобретаютособые свойства, позволяющие им проходить через клеточные мембраны.Дляформированияленгмюровскихмонослоеввданнойработеиспользовали два класса липидов: жирные кислоты и нуклеолипиды.

Жирныекислоты широко распространены в живой природе, являются одним изкомпонентов биомембран, и на долю жирных кислот приходится примерно 20%от общего количества липидов, «жестко» связанных с нативной ДНК. Тем неменее,вбольшинстверабот,посвященныхлипид-нуклеиновымвзаимодействиям, исследуется взаимодействие нуклеиновых кислот (НК) сцвиттерионными или катионными липидами, а анионные липиды (в т.ч. ижирные кислоты) оказались практически забытыми. Например, имеется многолитературных данных о строении комплексов нуклеиновых кислот соктадециламином, но отсутствует информация о комплексах со стеариновойкислотой, отличающейся от октадециламина зарядом гидрофильной частимолекулы (октадециламин – производное стеариновой кислоты, в которомкарбоксильная группа заменена на аминогруппу).Второйклассвеществ,использовавшийсядляформированияленгмюровских пленок, нуклеолипиды, представляют собой алкил-замещенныепроизводные природных азотистых оснований (аденин, тимин, гуанин,1цитозин).

Благодаря остатку жирной кислоты, молекулы нуклеолипидовнерастворимы в воде и могут формировать стабильные монослои. При этомсинтез нуклеолипидов проводился таким образом, что группы атомов,отвечающих за образование уотсон-криковских связей между азотистымиоснованиями,остаютсянетронутыми,вследствиечегонуклеолипидыприобретают присущую азотистым основаниям способность к избирательномусвязыванию по принципу комплементарности: аденин-тимин (урацил) игуанин-цитозин.ПриизучениивзаимодействияДНКскатионнымиамфифилами (например, с алифатическими аминами или поликатионами) илипри работе с тройными комплексами (фосфатидилхолин – 2-х валентныйкатион – нуклеиновая кислота), исследователь имеет дело, по сути, свзаимодействием заряженных молекул.

Нуклеолипиды дают возможностьперейти от рассмотрения проблемы на уровне зарядовых взаимодействий кследующему уровню детализации: учесть, что молекула нуклеиновой кислотыпредставляет собой не просто полимерную «нить», обладающую некимэлектрическим зарядом, а как «генетическая» молекула характеризуютсядетерминированной последовательностью азотистых оснований, входящих в еёсостав.

Нуклеолипиды будут связываться, формируя липидное окружение,только с определенными участками молекулы нуклеиновой кислоты, чтооткрывает подходы к созданию новых типов лекарственных средств и способових доставки.Нуклеолипидыкакмолекулярныекомпоненты,способныекизбирательному связыванию, могут быть использованы для конструированиясамоорганизующихся супрамолекулярных комплексов (концепция «снизувверх» - создание сложных молекулярных комплексов на основе более простыхпо строению исходных компонентов), что представляет большой интерес спрактическойточкивысокоспецифичныхзрения,например,биосенсоров.длясозданияНуклеолипиды,дешевыхисвязывающиесяскомплементарными им азотистым основаниям в цепочке нуклеиновой кислоты,могутформировать«слепок»сдобавленныхподмонослоймолекул2нуклеиновых кислот.

Для фиксации последовательности нуклеолипидов,заданноймолекулой-матрицей,вданнойработеиспользуютсядвухкомпонентные ленгмюровские пленки нуклеолипидов (функциональныйкомпонент) и дииновой кислоты (полимеризуемый амфифил).Объектисследования:объектомисследованияявляютсяфотополимеризуемые ленгмюровские монослои генейкозодииновой кислоты иамфифильных производных азотистых оснований, а также ленгмюровскиемонослоипроизводныхстеариновойкислоты,различающихсязарядомисследованияявляетсягидрофильной части молекулы.Предметисследования:предметомкомплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемымиленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды, а также липиднуклеиновые взаимодействия между нуклеиновым кислотами и модельнымимембранными структурами, сформированными из жирных кислот.Целью диссертационной работы является разработка и экспериментальноеобоснованиеметодикиформированияультратонкихориентированныхполимерных пленок, содержащих нуклеолипиды и фиксирующих ихвпоследовательности, заданной молекулами ДНК.Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующиезадачи:1.

Исследовать возможность избирательного связывания нуклеиновыхкислот, растворенных в субфазе, с нуклеолипидами, формирующимимонослой на границе раздела фаз вода-воздух.2. ИсследоватьвозможностьфотополимеризующуюсявстраиванияматрицумолекулАПАО(представляющуювсобойленгмюровский монослой диацетиленовых кислот), т.е. возможностьполучения истинных растворов смесей нуклеолипидов и дииновойкислоты в ленгмюровских монослоях.33.

Исследоватьзакономерностифотополимеризациисмешанныхмонослоев дииновой кислоты и нуклеолипидов; исследовать свойстваполучаемых при этом полимерных пленок (таких как стабильностьструктуры и механическая прочность).4. Разработатьметодикупереносаленгмюровскихмонослоев,содержащих нуклеолипиды, на твердые подложки с сохранениемспособностинуклеолипидовкизбирательномусвязываниюнуклеиновых кислот.5.

Изучить морфологию комплексов (методами АСМ) нуклеиновыхкислот с ленгмюровскими монослоями нуклеолипидов, жирных кислоти их смесей.Научная новизна диссертации1. Реализовано комплементарное связывание полирибонуклеотидов сискусственными полимеризующимися молекулярными структурами. Показаноизбирательное связывание нуклеолипидов, формирующих монослой на границераздела фаз вода-воздух с растворенными в воде комплементарнымиполинуклеотидами большой длины (1000-3000 оснований).2.

Разработан способ формирования на твердых подложках стабильных,моделирующихбиомембранымолекулярныхструктур,содержащихнуклеолипиды. Особенностью полученных нами структур является то, чтофункциональные группы молекул, формирующих внешний по отношению кподложке монослой, обращены наружу и способны взаимодействовать снуклеиновыми кислотами.3. Впервые обнаружено влияние структуры подложки на ориентациюмолекул нуклеиновых кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослояхстеариновой кислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, перенесенные вместе смонослоем стеариновой кислоты на свежесколотую слюду, формируютдомены, внутри которых цепочки нуклеиновых кислот ориентируютсяпараллельно друг другу.4Положения, выносимые на защиту1.Амфифильныепроизводныеазотистыхоснованийспособныформировать стабильные ленгмюровские монослои на поверхности воды,избирательно связывающие полирибонуклеиновые кислоты.2.

Амфифильные производные азотистых оснований могут быть встроеныв фотополимеризуемые монослои дииновых кислот и перенесены на твердыеподложки с сохранением своей функциональной активности – способности кизбирательному связыванию с комплементарными азотистыми основаниями.3. Структура подложки влияет на ориентацию молекул нуклеиновыхкислот, адсорбированных на ленгмюровских монослоях стеариновой кислоты.Молекулы НК, перенесенные вместе с монослоем стеариновой кислоты насвежесколотуюслюду,формируютдомены,внутрикоторыхцепочкинуклеиновых кислот ориентируются параллельно друг другу.Достоверность полученных результатовДостоверность результатов диссертационной работы обеспечиваетсякомплекснымиспользованиемэкспериментальныхметодовширокоисследований.известныхВыводы,иприменяемыхполученныеприиспользовании различных методов исследования, не противоречат друг другу исогласуются с результатами работ других авторов.Практическая значимость работыРеализованное нами специфическое связывание нуклеиновых кислот наискусственныхмолекулярныхструктурах,сформированныхнаосновефотополимеризующихся легмюровских монослоев, содержащих нуклеолипиды,формирует новые подходы к созданию биосенсоров на видоспецифичныефрагменты ДНК.

Причем для создания таких биосенсоров ДНК нетнеобходимости знать последовательности оснований ДНК, а достаточно иметьобразец ДНК, который будет использоваться в качестве матрицы для создания«распознающего» элемента биосенсора - монослоя смеси нуклеолипидов с5липидами, формирующими полимеризующуюся сетку, в которой фиксируетсяотносительное расположение молекул нуклеолипидов, заданное молекуламиДНК.Обнаруженныйэффектформированияупорядоченныхструктурмолекулами нуклеиновых кислот, адсорбированных на монослое стеариновойкислоты (при переносе на твердые подложки), может быть использован присоздании биочипов, отличающихся высокой плотностью упаковки и степеньюупорядоченности молекул ДНК.Апробация работы.