Комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды (1103430), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Изотермы сжатия монослоев смесей ГДК и ЭА, записанных как приоблучении УФ, так и без него.На основе представленных выше рассуждений были сделаны выводы отом, что монослои состава [ГДК]:[ЭА]=6:1 представляют собой идеальныедвумерные смеси и при их полимеризации не происходит разделения смеси накомпоненты, что эквивалентно встраиванию молекул АПАО в полимернуюматрицу ГДК. Также было предположено, что ленгмюровский монослой смесиолеилтиминасгенейкозодииновой[ГДК]:[ОТ]=6:1,кислотой,взятыхвсоотношениитоже будет представлять собой идеальный двумерныйраствор.АСМ исследования монослоев смесей различного состава подтвердиловыводы о смешиваемости, сделанные на основе анализа изотерм сжатия.Нарис.5апредставленоАСМизображениемонослоясмеси[ГДК]:[ОТ]=6:1.
Пленки смесей с низким содержанием нуклеолипидоввыглядят так же, как и монослои индивидуальных веществ, т.е. представляютсобой достаточно ровную поверхность, однородную по толщине (не считая13дефектов монослоя – пор монослоя), без каких либо признаков присутствия вмонослое участков различного состава. В отличие от этого, в монослоях смеси ссодержанием ЭА 40% ([ГДК]:[ЭА]=1.5:1) были обнаружены участки (домены)различного состава.
На рис. 5б хорошо заметны участки, различные по высоте,характерный размер таких областей – сотни нанометров. Перепад высот междутакими различными участками составляет около 0.3 – 0.4 нм.б)а)Рис. 5. А) АСМ изображение монослоя смеси [ГДК]:[ОТ]=6:1, Б) АСМизображение монослоя смеси [ГДК]:[ЭА]=1.5:1. Монослои переносились споверхности чистой воды на твердую подложку (свежесколотая слюда,модифицированная монослоем стеариновой кислоты).Четвертая глава посвящена исследованию избирательного связываниянуклеиновыхкислот,растворенныхвсубфазе,снуклеолипидами,формирующими монослои на поверхности раствора.
Исследуется связываниеполиадениловой кислоты со смешанными монослоями генейкозодииновойкислоты и олеилтимина (комплементарного аденину) на поверхности воды иперенесенных на твердую подложку.Для изучения взаимодействия ленгмюровских монослоев нуклеолипидов снуклеиновыми кислотами были записаны их изотермы сжатия на субфазе,содержащей синтетические гомополимеры нуклеиновых кислот: полиА, полиУ,полиЦ, полиГ кислоты в концентрации 3 мкг/мл, рис 6.1435231 ЭА на 1M NaCl3 ОТ на полиУ204 ЭА на полиГ202 ОТ на полиА253 ЭА на полиА11 ОТ на 1М NaCl302 ЭА на полиУ304Поверхностное давление, мН/мПоверхностное давление, мН/м40151010а)01б)52300501002Площадь на одну молекулу, Å150040802Площадь на одну молекулу, Å120Рис.
6 изотермы сжатия монослоев а) эруциладена и б) олеилтиминана растворах полинуклеотидов в 1М растворе NaCl.Для монослоев эруциаладенина максимальные изменения в изотермахсжатия происходили при наличии в субфазе молекул полиурациловой кислоты,для монослоев олеилтимина – полиадениловой кислоты, что доказываетобразованиекомплементарныхводородныхсвязеймеждуостаткаминуклеолипидов в монослое и НК в объеме субфазы.АСМисследованиекомплексов,формируемыхленгмюровскимимонослоями нуклеолипидов с растворенными в субфазе нуклеиновымикислотами подтверждает вывод о комплементарном связывании. ПолиА приодних и тех же условиях в гораздо больших количествах адсорбируется намонослой ОТ (рис. 7а), чем на монослой ЭА (рис.
7б).15б)а)Рис. 7 АСМ изображение молекул полиА, адсорбированных на а) монослоеОТ, б) монослое ЭА, сформированных на растворах полиА концентрации 3мкг/мл в чистой воде.Монослои нуклеолипидов, перенесенные на твердые подложки, обладаютнизкой механической стойкостью, что является препятствием для ихпрактическогоСпособомиспользования.преодолетьэтотнедостаток является использованиепленок дииновых кислот, которыепослеполимеризацииотличаютсявысокой механической прочностью.Полимеризующиеся ленгмюровскиепленки формировались из смеси[ГДК]:[ОТ]=6:1какидеальносмешивающейся.На рис.8 представлено АСМизображение монослоя смеси [ГДК] :[ОТ] = 6:1, сформированной насубфазе,содержащейконцентрации 3 мкг/мл.полиаденинРис.
8. АСМ изображение молекулполиаденина, адсорбированных намонослое смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1.Видимаявысотамолекулприблизительно 0.6-0.8 или 1.6 нм(возможно, что молекулы лежат водин или в два слоя), ширина 10-14 нм.16На поверхности образца присутствует большое количество молекулполиаденина, адсорбированных на монослой, содержащий нуклеолипиды, чтоподтверждаетвозможностьсвязываниянуклеиновыхкислотсполимеризуемыми монослоями, содержащими АПАО.Далее был исследован вопрос о механической стойкости ленгмюровскихпленок генейкозодииновой кислоты со встроенными в нее молекулами АПАО,а также способность таких пленок к связыванию нуклеиновых кислот послепереноса на твердую подложку.
Для этого сначала монослои смеси [ГДК] : [ОТ]= 6:1 переносили с поверхности чистой воды, а после этого:•Либо подложку с нанесенным на неё монослоем смеси повторнопогружали в раствор, содержащий полиА.•Либо сначала полимеризовали монослой, перенесенный на подложку, итолько после этого повторно погружали в раствор, содержащий полиА.Схема приготовленияобразца:Перенос монослоя смеси[ГДК]:[ОТ]=6:1 нагидрофобизированную слюдуПогружение подложки враствор полиАНеполимеризованныймонослой разрушаетсяРис.
9. АСМ изображение монослоя смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1 послеповторного погружения подложки в раствор.Характеристика полученного изображения: Очень хорошо виднадвухслойная структура пленки. Верхний слой сильно разрушен.17Оказалось, что неполимеризованные монослои генейкзодииновой кислотыи нуклеолипидов перенесенные на гидрофобизированную слюду, смываются сподложки при её повторном погружении в жидкость, рис. 9.Но если монослой смеси ГДК+ОТ после переноса на твердую подложкуполимеризовать путем УФ облучения, то при повторном погружении вжидкость он не только не разрушается, но и адсорбирует на себя НК,растворенные в субфазе, рис.
10. Это подтверждает большую механическуюстойкостьполимеризованныхмонослоев,иговоритосохранившейсяфункциональной активности нуклеолипидов, встроенных в полимернуюматрицу.Схема приготовленияобразца:Перенос монослоя смеси[ГДК]:[ОТ]=6:1 нагидрофобизированную слюдуУФ-облучение(полимеризация) монослоя,перенесенного на твердуюподложкуПогружение подложки в 1M р-рNaCl, содержащий полиА(3 мкг/мл)Полимеризованный монослой сохраняется, на егоповерхности наблюдаются нитевидные структурыРис.
10. АСМ изображение полимеризованного монослоя смеси[ГДК] : [ОТ] = 6:1, сформированного на чистой воде, после повторногопогружения в раствор, содержащий полиаденин.18Однако,наконтрольныхизображениях монослоя ГДК, рис.11,полученногосрастворхлориданатрия,содержащегополиаденин,былиобнаруженымолекулынуклеиновыхкислот.ХотянамонослойГДКадсорбируетсяменьшееколичествоНК, чем намонослой олеилтимина (рис. 7а) илина монослои смеси [ГДК] : [ОТ] = 6:1,такоенеспецифическоемолекулНКсмонослоямиявляетсяРис. 11. АСМ изображениемонослоя генейкозодииновойкислоты, перенесенного споверхности раствора,содержащей полиаденин (3 мкг/мл).связываниеГДКнежелательным,«паразитным»,длясозданиябиосенсоров на основе фотополимеризующихся монослоев, содержащихмолекулы АПАО.В пятой главе описаны результаты изучения комплексов нуклеиновыхкислот с монослоями жирных кислот. Для формирования ленгмюровскихбыластеариноваявыбранакислота,свойстват.к.монослоевстеариновойподробнокислотыоченьописанывлитературе.Видизотермсжатиястеариновой кислоты (рис.
12)на чистой воде и на растворахсолиформойотличаютсятолькоколлапса;наличиеПоверхностное давление, мН/мпленок1 субфаза - чистаявода706023502 субфаза - 500мМ раствор NaCl40301203 субфаза - 500мМ NaCl + полиА 1мкг/мл100101520253035402Площадь на одну молекулу, ÅРис. 12. Изотермы сжатия монослоевстеариновой кислоты на растворах,содержащих НК.19полиаденина не сказывается на форме изотерм сжатия монослоев.
Добавлениеполиаденина в субфазу под монослой стеариновой кислоты не изменяетсреднюю площадь, приходящуюся на одну молекулу в точке коллапсамонослоя. Это говорит о том, что молекулыполиаденина, еслииадсорбируются на монослой, но не встраиваются между молекулами монослоя,и не образуют стабильных при поджатии монослоя комплексов с молекуламистеариновой кислоты.РезультатыперенесенныхАСМнаисследованиясвежесколотуюмонослоевслюдусстеариновойсубфазы,кислоты,содержащейполиадениловую кислоту (1 мкг/мл), представлены на рис. 13.
Если в субфазу срастворенным в ней полиА добавлялся NaCl в концентрации 1 мМ (или недобавлялся вообще), то перенесенный на подложку монослой ничем неотличается от монослоя, перенесенного с чистой воды.При увеличении концентрации одновалентных ионов (10 мМ раствор NaCl,но, по-прежнему, без специально добавленных солей 2-х валентных металлов)на поверхности образцов начинают обнаруживаться одиночные молекулынуклеиновых кислот, рис. 13а. При концентрации хлорида натрия в 100 мМ,рис.
13б, молекулы нуклеиновых кислот уже стремятся образовывать некиеагрегаты на поверхности образца, но такие «скопления» расположены поповерхности образца хаотичным образом.При концентрации NaCl в субфазе 500 или 1000 мМ (рис. 13в и рис. 13г) наповерхности образца в больших количествах обнаруживаются молекулынуклеиновых кислот, при этом поверхность образца (каждый образецисследовался не менее чем в 3х различных точках) однородна, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
