Комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды (1103430), страница 4
Текст из файла (страница 4)
схожиекартины получались при сканировании различных участков образцов.Молекулы полиаденина находятся по подложке в вытянутом состоянии иобразуют на поверхности домены с поперечными размерами несколько сотеннанометров (т.е. с размерами близкими к длине молекул использовавшихсяНК), внутри одного домена нити НК расположены параллельно друг другу.20а)б)в)г)Рис. 13. Стеариновая кислота, перенесенная на свежесколотую слюду споверхности раствора, содержащего полиА (1 мкг/мл). Концентрация NaCl(USP grade) а) 10 мМ, б) 100 мМ, в) 500 мМ, г) 1000 мМ.
Без специальногодобавления ионов Mg. Содержание двухвалентных катионов виспользовавшемся NaCl (USP grade) не более 0.001%.21а)б)в)Рис. 14. Стеариновая кислота, перенесенная на свежесколотую слюду споверхности раствора, содержащего полиА (1 мкг/мл).Концентрация NaCl 500 мМ, концентрация специально добавленных ионов Mgа) 0.01 мМ, б) 0.1 мМ, в) 1 мМ.При увеличении в субфазе концентрации двухвалентных ионов (припостоянной концентрации NaCl 500 мМ) количество нуклеиновой кислоты,связанной с монослоем увеличивается, рис. 14. Добавление 10-5 M ионов Mg неприводит к заметному росту количества НК, связанных с монослоем, а вот ужепри наличии в субфазе 10-4 М ионов Mg с монослоем связывается гораздобольшее количество полиА.
При добавлении в субфазу 1 мМ количество НК,связанных с монослоем, продолжает увеличиваться (молекулы полиА на рис.14в лежат в 2 слоя), но никаких нематически подобных структур, как это былопри концентрации ионов Mg 0.01 мМ и менее, не обнаруживается.22Образец, представленный на рис.
15 был получен при тех же условиях, чтои на рисунке 13в (субфаза – раствор полиадениловой кислоты концентрации 1мкг/мл в 500 мМ растворе хлорида натрия), за одним исключением: монослойстеариновойкислотысадсорбированныминанегомолекуламиполирибонуклеотидов переносился не на свежесколотую слюду, а на слюдянуюподложку, предварительно покрытую монослоем стеариновой кислоты.Никаких закономерностей в расположении молекул полиаденина на рис.
15 ненаблюдается. Предварительно нанесенный на слюду монослой стеариновойкислоты нейтрализует влияние слюды на последующие слои, что подтверждаетпредположение о влиянии структуры подложки на упаковку переносимогомонослоя и связанных с ним молекул НК.Рис. 15. АСМ изображениемонослоя СК, перенесенного сраствора, содержащего полиА.На подложку был предварительнонанесен монослой стеариновойкислоты.Рис. 16. АСМ изображениемонослоя стеариновой кислоты,перенесенного с раствора 1МNaCl + 0.001 мг/мл полиаденин +10 мМ ЭДТА.Если при формировании ленгмюровского монослоя в субфазу (1М растворNaCl USP grade + 1 мкг полиА) добавлялся хелатирующий агент (10 мМЭДТА), рис.
16, то поверхность образца при АСМ исследовании выгляделапочти так же, как монослой стеариновой кислоты перенесенный с чистой воды,если не считать небольшого количества глобул и редких нитевидных23образований – редких молекул полиадениловой кислоты, все-таки связавшихсяс монослоем. Резкое уменьшение числа молекул НК, связавшихся с монослоемстеариновой кислоты в присутствии ЭДТА является сильным аргументом впользу того, что 2-х валентные катионы действительно играют роль мостиковмежду молекулами НК и жирных кислот.Образования комплексов между монослоями октадеканола (стеариновогоспирта) и нуклеиновыми кислотами ни с помощью изотерм сжатия, ни приАСМ исследовании монослоев октадеканола обнаружить не удалось.После того, как было обнаружен факт формирования нематическиупорядоченных структур нуклеиновыми кислотами, адсорбированными накислотыстеариновойпривысокихзначенияхионнойсубфазы,былосилырешенопровести несколько опытовпо формированию при тех жеусловияхЛБпленок60Поверхностное давление, мН/ммонослояхоктадециламина (ОДА), рис.17.Видизотермирастворе402 суфаза - растворполиА (1 мкг/мл) вчистой воде201полиАсовпадает с описанными в20010203040250Площадь на одну молекулу, Åсжатияоктадециламина на чистойводе1 субфаза - чистаяводаРис.
17. Изотермы сжатиямонослоев октадециамина на чистойводе и на растворе полиадениловойкислоты.литературе.РезультатыАСМисследованийленгмюровскихпленокОДА,сформированных на растворах полиаденина в чистой воде, рис. 18, совпадают срезультатами, описанными в работах Г.Б. Хомутова для комплексов ОДА сДНК, сформированных на 1 мМ растворе хлорида натрия. Катионные молекулыОДА «обвалакивают» противоположно заряженные молекулы молекулынуклеиновых кислот, в результате чего молекулы НК адсорбируются наповерхость монослоя в виде глобул.24Рис.
19. АСМ изображениеленгмюровских пленок ОДА,перенесенных с раствораполиА (1 мкг/мл) в 500 мМNaCl.Рис. 18. АСМ изображениеленгмюровских пленок ОДА,перенесенных с раствора полиА(1 мкг/мл) в чистой воде.Когдакомплексыполинуклеотидовсленгмюровскимипленкамиформировались на субфазах высокой ионной силы (500 мМ NaCl), то видполучаемыхкомплексовменялсякардинально.Вместоглобул(малаяконцентрация хлорида натрия в субфазе или полное его отсутствие) на АСМизображении, рис. 19, наблюдается «сеть» из нитей различной ширины (от 20до 40 нм) и высоты (2-5 нм). Отчетливо видны «толстые» и «тонкие» нити, какбудто они переплетаются между собой.
«Тонкие» нити – толщиной 20-25 нм,высотой – 2 нм, «толстые» в ширину 35-40 ни, высотой 5 нм (иногда до 7 нм).Влитературенеудалосьобнаружитькаких-либосведенийокомплексообразовании между ОДА и нуклеиновыми кислотами при высокихзначениях ионных силы. Однако, похожие «сетки» были обнаружены в работахГ.Б. Хомутова, посвященных изучению комплексов НК с монослоямикатионных полимеров, сформированными на растворах низкой ионной силы (1мМ NaCl). Значительные поперечные размеры «толстых» нитей, наблюдаемыхна рис. 19, можно объяснить тем, что мы наблюдаем нити нуклеиновых кислот,«облепленные» слоем аминов.25ЗаключениеРеализованокомплементарноесвязываниенуклеиновыхкислотсдвумерными искусственными полимеризуемыми молекулярными структурами.Разработана технология получения стабильных ультратонких ориентированныхмолекулярныхпленок,содержащихнуклеолипидыссохранениемихфункциональной активности.На основании обширных экспериментальных исследований авторомустановлены общие закономерности встраивания в полимеризуемые монослоисинтезированных по нашему заданию амфифильных производных азотистыхоснований с предложенной нами структурой, позволяющей реализоватьпринципы самоорганизации и молекулярного узнавания на границе разделафаз.
Полученные результаты являются ключевыми в разработке новых методовформирования упорядоченных молекулярных структур в ленгмюровскихпленках на основе матричного принципа репликации ДНК. Оригинальностьпредлагаемой методики состоит в том, что добавляемые под монослойбиомакромолекулы используются в качестве матрицы, на которой формируетсякомплементарный «слепок» из молекул монослоя с последующей фиксациейполученной последовательности нуклеолипидов в полимерной матрицемонослоя.Результаты и выводы1. Показано, что нуклеолипиды с заданной нами структурой обладаютповерхностно-активными свойствами и могут образовывать стабильныемонослои на поверхности водной субфазы. Нуклеолипиды способныобразовывать уотсон-криковские пары с комплементарными азотистымиоснованиями.
Реализовано комплементарное связывание молекул РНК смонослоями нуклеолипидов.2. Определены соотношения компонентов, при которых образуются истинныедвумерные растворы смесей нуклеолипидов и генейкозодииновой кислоты вленгмюровскихпленках.Полноесмешиваниекомпонентовсмеси26сохраняется при переносе монослоев на твердые подложки и приполимеризации монослоя, что приводит к фиксации молекул нуклеолипидоввполимернойматрицеиповышениюмеханическойпрочностииоднородности монослоя.3. Разработан способ формирования на твердых подложках стабильныхультратонкихориентированныхполимерныхмолекулярныхпленок,содержащих нуклеолипиды с сохранением их функциональной активности.4. Продемонстрировано комплементарное связывание полирибонуклеотидов снуклеолипидами, включенными в полимерные пленки на поверхноститвердых подложек, что открывает новые возможности в созданиибиосенсоров нуклеиновых кислот на основе принципа репликации ДНК сфиксациейполученнойпоследовательностинуклеолипидовпутёмфотополимеризации монослоя.5.
Впервые обнаружено влияние структуры подложки на ориентацию молекулнуклеиновых кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослояхстеариновой кислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, перенесенные вместес монослоем стеариновой кислоты на свежесколотую слюду, формируютдомены, внутри которых цепочки нуклеиновых кислот ориентируютсяпараллельно друг другу.Основное содержание диссертационной работы отражено в следующихпубликациях:1. E. V. Dubrovin, S. N. Staritsyn, S. A. Yakovenko, I.
V. Yaminsky. Self-organizedstructures of polyA molecules on the stearic acid LB monolayer. // 15th IUPAB &5th EBSA International Biophysics Congress – Montpellier, France. EuropeanBiophysics Journal, 2005, V 34, №6, p 669.2. С.Н. Старицын, Е.В. Дубровин, А.М. Ломоносов. Самоорганизациянуклеиновых кислот на ленгмюровских пленках стеариновой кислоты. //Тезисы международной школы-конференции «Молодые ученые – новойРоссии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
