Комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды (1103430), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Основные результаты диссертационной работы былидоложены на следующих научных конференциях и школах:- Международный биофизический конгресс – 2005 (15th IUPAB & 5thEBSA International Biophysics congress), Монпелье, Франция.- II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии"МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА – 2005", Москва, Россия, 2005.- 14ая Международная конференция аспирантов и молодых ученых(14th Annual Conference of Doctoral Students “Week of DoctoralSrudents 2005”), Прага, Чехия, 2005.- Международная школа-конференция «Молодые ученые – новойРоссии.
Фундаментальнее исследования в области химии иинновационная деятельность», Иваново, Россия, 2005.- III съезд биофизиков России, Воронеж, Россия, 2004.- Международнаяконференциястудентовиаспирантовпофундаментальным наукам «Ломоносов-2005», «Ломоносов-2004»,«Ломоносов-2002», Москва, Россия, 2005, 2004, 2002.- Научная конференция «Ломоносовские чтения 2002», Москва,Россия, 2002.- XVI международная конференция молодых ученых по химии ихимической технологии "МКХТ-2002", Москва, Россия, 2002.Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.6Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения,пяти глав, заключения и выводов, списка литературы. Работа изложена на 121странице, содержит 60 рисунков и 2 таблицы, список литературы содержит 137библиографических ссылок.Основное содержание работыВо введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель иопределены задачи исследования, изложены научная новизна и практическаязначимость полученных результатов, перечислены положения, выносимые назащиту.Первая глава содержит обзор литературы по теме диссертации.В разделе 1.1 кратко изложены основные сведения о ленгмюровскихмонослоях на поверхности жидкости, а также о пленках Ленгмюра-Блоджетт натвердотельных подложках.
Перечислены методы, применяемые для изученияленгмюровских пленок, в т.ч. используемые для изучения однородностимногокомпонентных пленок. Приведены литературные данные о свойствахфотополимеризуемых ленгмюровских пленок диацетиленов.В разделе 1.2 рассматриваются основы методов зондовой микроскопии, вчастности, атомно-силовой микроскопии (АСМ), описываются различныережимы работы АСМ и особенности применения атомно-силовой микроскопиидля исследования нуклеиновых кислот.Вразделе1.3представленыданныеолипид-нуклеиновыхвзаимодействиях.
Описаны результаты изучения комплексов нуклеиновыхкислот с цвиттер-ионными, катионными и анионными липидами. Отдельноевнимание уделено взаимодействию нуклеиновых кислот с искусственносинтезируемымклассомвеществ,невстречающимсяinvivo-снуклеолипидами, способными к избирательному связыванию с азотистымиоснованиями, входящими в состав нуклеиновых кислот.7Во второй главе подробно описаны материалы и методы, использованныевработе.Описаноустройстволенгмюровскойванныиметодикаформирования, переноса на твердые подложки и исследования комплексовленгмюровских монослоев с нуклеиновыми кислотами.В работе были использованы амфифильные вещества - нуклеолипиды,представляющие собой амфифильные производные азотистых оснований(АПАО), рис.
1, специально синтезированные по нашему техническомузаданию В.В. Захарычевым и В.В. Мамашиным, РХТУ им. Д.И. Менделеева.NCH3NNH2NNNа)NH2Nб)CH3NONHNв)CH3NOCH3Рис. 1. Структурные формулы нуклеолипидов (АПАО): а) эруциладенин, б)олеиладенин, в) олеилтимин.Отличительной особенностью синтезированных соединений является то,что липофильный остаток (эруковой или олеиновой кислоты) присоединен казотистому основанию в том положении, где в нуклеиновых кислотах казотистому основанию присоединен остаток сахара.
Таким образом, группыатомов,отвечающиезаобразованиеводородныхсвязеймеждукомплементарными основаниями, не затронуты в ходе синтеза и способныобеспечить возможность специфического узнавания и связывания АПАО свеществами, имеющими(например,адениндляв своем составе комплементарные основанияолеилтимина).Липофильнаячастьмолекулнуклеолипидов имеет ненасыщенную двойную связь, что при некоторыхспециальных условиях (в инертной атмосфере при облучении «вакуумным»ультрафиолетом) дает возможность их полимеризации.8Для получения легко полимеризующейся сетки (второй компонент дляформирования смешанных монослоев) была взята генейкозо-10,12-дииноваякислота (ГДК), рис. 2.
Она содержит две сопряженные тройные связи, т.е.является диацетиленовым амфифилом, а ЛБ пленки диацетиленов легкополимеризуются при УФ-облучении с λ < 300 нм.OHOCH3Рис. 2. Структурная формула генейкозо-10,12-дииновой кислоты (ГДК).Обратим внимание, что молекулы АПАО и ГКД имеют примерноодинаковую длину (18-22 атома углерода), а также то, что все они имеют всоставе липофильной части ненасыщенные связи, расположенные примерно наодном уровне, что облегчает смешение этих веществ в многокомпонентныхленгмюровских пленках.Нуклеиновымикислотами,использовавшимисявработе,былигомополимеры рибонуклеиновых кислот, а именно полиадениловая (полиА),полиурациловая (полиУ), полигуаниловая (полиГ), полицитозиновая (полиЦ)кислоты производства компании Sigma.Для переноса ленгмюровских монослоев ГДК и АПАО использовалисьподложки из слюды, покрытые монослоем стеариновой кислоты.Для исследования морфология перенесенных пленок и их комплексов снуклеиновымикислотамииспользовалисьметодыатомно-силовоймикроскопии.9Третья глава посвящена исследованию свойств монослоев АПАО наповерхности воды.
Изучается возможность формирования истинных смесейАПАО с ГДК в двумерной фазе (возможность встраивания молекул АПАО вмонослои полимеризуемой генейкозодииновой кислоты) и закономерностифотополимеризации монослоев таких смесей.Поверхностное давление, мН/м1 олеилтимин2 олеиладенин3 эруциладенин2012310а)Поверхностное давлене, мН/м30301 ГДК без УФоблучения22 ГДК при УФоблучении20110б)00020406080Площ адь на одну молекулу,1002Å02040Площ адь на одну молекулу,2Å60Рис. 3. Изотермы сжатия монослоев (а) нуклеолипидов,(б) генейкозодииновой кислоты.Из анализа изотерм сжатия АПАО, рис. 3а, делаются выводы, что остаткиазотистых оснований обладают достаточной гидрофильностью, чтобы АПАОбыли способны формировать стабильные ленгмюровские монослои наповерхности воды.
Для АПАО площадь, приходящаяся на молекулу в точкеколлапса, лежит в интервале 25-36 Å2. Из этого следует, что гетероциклыазотистых оснований в монослоях нуклеолипидов ориентируются своимиплоскостями перпендикулярно к поверхности раствора, как бы становятся «наребро», и при этом находятся в плотном контакте друг с другом.Углеводородные цепочки нуклеолипидов, очевидно, обращены в газовую фазу,а группы атомов, отвечающих за образование уотсон-криковских водородныхсвязей, оказываются ориентированными в сторону жидкой субфазы.На рис. 3б представлены изотермы сжатия монослоев ГДК, полученные вразных условиях: при облучении монослоя ультрафиолетом во время сжатия ибез такового.
Остальные условия при формировании и сжатии монослоев были10одинаковы: субфаза – чистая вода, скорость сжатия монослоя составляла 3Å2/молекула*мин. При этом суммарное время сжатия монослоя составляло 3040 минут (по литературным данным для полимеризации монослоя необходимо30 минут).Изотерма, полученная при сжатии без воздействия ультрафиолетом, имеетвид, характерный для дииновых кислот. Средняя площадь, приходящаяся наодну молекулу в коллапсе, А≈24 Å2 (что характерно для гомологического рядаCOOH(CH2)8C≅C-C≅C(CH2)nCH3, n=7-15), поверхностное давление в точкеколлапса составляет ≈16 мН/м.При УФ облучении характер получаемой изотермы менялся кардинально.Различие изотерм сжатия при облучении УФ светом и без облучения являетсядоказательствомтого,чтоленгмюровскийслойполимеризуется.Приоблучении в течение 30 минут монослоя, находящегося в «газовой» фазе(средняя площадь на молекулу ≈100 Å2) и его последующем поджатии уже безвоздействия УФ, никаких изменений в изотерме по сравнению со случаем,когда вообще никакого воздействия УФ не было, не наблюдалось.
Этодоказывает, что при одновременном поджатии и УФ облучении происходитименно фотополимеризация (которая требует сближения полимеризуемыхмономеров), а не, например, фоторазложение ГДК. Если бы при УФ облучениипроисходила не фотополимеризация, а некий мономолекулярный процесс,например фоторазложение ГДК, то УФ облучение уже в «газовой» фаземонослоя сказывалось бы на изотерме, чего в эксперименте не наблюдается.Полимеризованные монослои ГДК проявили типичные свойства полимерныхмонослоев, описанные в литературе: они более стабильны (выдерживалисжатиедобольшегоповерхностногодавления~24мН/м)иболееконденсированные (площадь коллапса монослоя сдвинулась с 24 до 17Å2/молекулу).УФ облучение монослоев эруциладенина (ЭА) или олеилтимина (ОТ) какдо начала движения барьера, так и во время сжатия монослоя не приводило ккаким-либо изменениям в изотермах сжатия, что подтверждает (по крайней11мере, в условиях проведения данных опытов) 1) фоторезистентностьнуклеолипидов, 2) невозможность полимеризации нуклеолипидов между собойпо ненасыщенным связям в остатках жирной кислоты, 3) отсутствиефотополимеризации остатков тимина между собой.Для установления смешиваемости ЭА и ГДК между собой были записаныизотермы сжатия монослоев смесей различного состава в различных условиях:с облучением УФ во время сжатия или без УФ облучения, рис.
4.Вид изотерм сжатия монослоев смесей ГДК с ЭА существенно зависит отсоотношения компонент, а также от того, производилось ли УФ облучениемонослоя во время сжатия. Для смесей с низким содержанием ЭА вид изотермсжатия (рис. 4а) напоминает изотермы для монослоев чистой ГДК (рис. 3б). Сувеличением содержания ЭА на изотермах появляются горизонтальные плато иточки перегиба, которые могут быть объяснены фазовым разделениеммонослоя на компоненты. Различные участки монослоя ввиду различногосоставамогутполимеризоватьсянеодновременно(либовообщенеполимеризоваться), а также обладать разной сжимаемостью. Сначала мынаблюдаем сжатие монослоя как целого, потом одна из компонент монослояколлапсирует, чему соответствует горизонтальный участок изотермы.
Наиболеепоказательны в этом смысле изотермы сжатия монослоев смеси с соотношениекомпонент [ГДК]:[ЭА]=1.5к2 (рис. 4б). Когда монослой поджимается безодновременного воздействия ультрафиолетом, то, при поверхностном давлении16 мН/м, мы видим коллапс участков монослоя, состоящих из ГДК (коллапсмонослоев ГДК происходит при 16 мН/м). Если монослой смеси при поджатииоблучать УФ, то участки, состоящие из ГДК, полимеризуются и могутвыдержать поджим до более высоких давлений, и поэтому первымиколлапсируют участки монослоя, состоящие из ЭА (при поверхностномдавлении 24 мН/м, что близко к значениям, при которых коллапсируютмонослои ЭА).Таким образом, меняя условия проведения эксперимента (сжатие монослояпроводили с одновременным УФ облучением или без такового), удалось12продемонстрировать наличие в монослое участков различного состава, поразному «реагирующих» на включение/выключение УФ.302а)[ГДК]:[ЭА] == 3:120Поверхностное давление, мН/мПоверхностное давление, мН/м25115105б)25[ГДК]:[ЭА] == 1.5:2220115105000204060080220406080Площадь,приходящаяся на одну молекулу,Площадь,приходящаяся на одну молекулу, Å2Å1 Смесь ГДК и ЭА, сжатие со скоростью 3 Å2 /молекулу*мин без облучения УФ2 Смесь ГДК и ЭА, сжатие со скоростью 3 Å2 /молекулу*мин с УФ облучениемРис 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
