Автореферат (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов), страница 4

В то жевремя увеличение силы дезагрегации при уменьшении площади взаимодействияэритроцитов не может быть описано имеющимися моделями. Таким образом,необходимоусовершенствоватьмодели,описывающиемеханизмывзаимодействия эритроцитов. В данной главе проделана количественная оценкаэнергии взаимодействия на базе измерении сил при САЭ и ДАЭ. Полученныеданные сравнены с существующими моделями взаимодействия эритроцитов,приведена дискуссия по возможному способу описания взаимодействияэритроцитов.В частности, для описания ДАЭ в плазме и растворах белков мыиспользовали модель «подвижных мостиков», ранее использованную в другимиавторами для описания взаимодействия лейкоцита с мишенью и агглютинацииэритроцитов.

Следует отметить, что агглютинационное взаимодействиепримерно на два порядка сильнее, чем агрегационное. Модель «подвижныхмостиков» может считаться расширенной моделью «мостиков», и здесь мыкратко опишем ее перед тем, как перейти к нашим результатам.4.1. Модель «подвижных мостиков»Модель «подвижных мостиков», используемая в нашей работе,изначально была разработана для описания взаимодействия лейкоцитов смишенью. Авторы модели получали зависимость энергии взаимодействия (E)лейкоцита и мишени по динамике разделения лейкоцита и мишени с помощьюметода аспирации в микропипетку.

Способ измерения Е включал множествоэтапов, учитывающих жесткость клетки и ее деформацию, а также локальноеприложениедавлениямикропипетками,которыездесьподробно18рассматриваться не будут. Для этих клеток наблюдалось значительноеувеличение E по мере их разделения, что сопоставимо с ДАЭ в плазме ирастворах белков (рис. 5., гл. 3). Такой характер взаимодействия описывалсямоделью «подвижных мостиков»: увеличение E по мере уменьшения площадивзаимодействия клеток объясняется тем, что «мостики» могут перемещаться помембране клетки, и по мере смещения клеток относительно друг друга«мостики» могут стягиваться, а также образуются новые «мостики». В итоге Еувеличивается, если стягивание и образование «мостиков» преобладает над ихразрушением. Была получена формула, по которой рассчитывается Е для данноймодели. Здесь мы приведем только конечный вид (вывод формулы описанподробно в работе.E  2kTm0b / [1  b(Si / S0 )](3)Здесь E – энергия взаимодействия эритроцитов, – площадь взаимодействияэритроцитов, 0 – начальная площадь взаимодействия клеток, 0 – начальнаяплотность «мостиков» до адзегии, b – безразмерный параметр прочности«мостика», k – коэффициент Больцмана, T – абсолютная температура.Параметры b, 0 получаются численными методами, а остальные параметрымогут быть непосредственно измерены.4.2.

Оценка энергии взаимодействия эритроцитов на базерезультатов, полученных с помощью лазерного пинцетаОценка энергии взаимодействия эритроцитов по измерениям,выполненным с помощью ЛП, проводилась следующим образом. Измеренныезначения силы взаимодействия F, представленные в главе 3 на рис. 5,использовались для вычисления работы, необходимой для относительноголинейного смещения эритроцита ∆A.

Для вычисления работы использоваласьпростая механическая модель, представленная на рис. 6 (а). Работа дляпередвижения эритроцита (U) вычислялась как U = F ✕ ∆A. Такой подход былвозможен в виду того, что измерялись минимальные силы, характеризующиеДАЭ. Работа, затрачиваемая для разделения пары эритроцитов, рассчитываласьпоэтапно, для каждых FD и ∆A, как показано на рис. 6 (б). Для полногоразделения эритроцитов в плазме затрачивалась энергия U = 148 ± 49 аДж.4.3. Расчет плотности энергии взаимодействия эритроцитовПлотность энергии взаимодействия эритроцитов (E, мкДж/мкм2) былаполучена как отношение работы к площади взаимодействия эритроцитов.

Быларассчитана E для процесса ДАЭ в плазме и растворе декстрана (рис. 7). Хорошо19видно, что в растворе декстрана E остается постоянной, а в плазме, напротив, Eвозрастает по мере разделения клеток.Рис. 6. (а) Схема этапов получения оценки работы, необходимой для дезагрегацииэритроцитов. Крестиками отмечены положения ЛП, стрелка обозначает направлениедвижения эритроцита по мере дезагрегации. (б) Работа, затрачиваемая для дезагрегацииэритроцитов в плазме.Зависимость, наблюдаемая для ДАЭ в плазме, похожа на ту, котораяимеет место в модели «подвижных мостиков». Получая параметры b и m0численным методом и рассчитывая энергию взаимодействия по формуле (3), мынаблюдаем хорошую корреляцию экспериментальных результатов (рис. 7,зеленая кривая, идущая рядом с зависимостью для плазмы) с моделью«подвижных мостиков».

Обоснование использования модели «подвижныхмостиков» для описания взаимодействия эритроцитов в плазме, следующее: (1)белки, в частности, фибриноген могут связываться специфически и неспецифически с мембраной эритроцита; (2) мембрана эритроцита являетсяподвижной; (3) практически все элементы мембраны эритроцитов могутперемещаться.

Из этого следует, что подвижность точек связывания вполнеможет иметь место при взаимодействии эритроцитов. При этом эффектвозрастания силы, наблюдаемый при ДАЭ, объясним аккумуляцией «мостиков».Экспериментальные факты, полученные в данной работе, также служатдополнительными аргументами в пользу использования данного механизма дляописания взаимодействия эритроцитов.20Эти аргументы такие: (1) Зависимость сил при дезагрегации (а следовательно иэнергии взаимодействия) в растворе белков (фибриногена с альбумином)совпадает с плазмой, как можно видеть из рис. 5). При этом САЭ отсутствует врастворе белков. Это согласуется с литературными данными.

В отсутствиисторонних сил, мембраны эритроцитов не могут приблизиться достаточноблизко, чтобы образовать «мостик». Мы показываем, что эритроциты врастворах белков действительно спонтанно не агрегируют, но будучиприведенными в контакт друг с другом, прочно связываются. Следует отметить,что взаимодействие, наблюдаемое в растворе белков, трудно представить вкачестве проявления осмотических сил, т.к. механизм «обедненного слоя»исключаетвозможностьотсутствияСАЭ.Такимобразом,нашиэкспериментальные результаты подтверждают роль молекул фибриногена иальбумином в качестве «мостиков», удерживающих агрегат.Рис.

7. Зависимости энергии взаимодействия эритроцитов при их дезагрегации отсмещения эритроцитов. Теоретические зависимости для плазмы – модель «подвижныхмостиков», для декстрана – модель «обедненного слоя».(2) Сравнение сил в плазме и сыворотке крови (рис. 2) (на рисунке мыприводим только сравнение скоростей, а в тексте сравниваются и силы),показывает значительную роль фибриногена в САЭ, но только в комплексе сдругими компонентами плазмы.

Можно предположить, что осмотические силыпроявляются в комплексе с другими компонентами крови и фактически21являются силами, приближающими эритроциты достаточно близко, чтобыобразовывались «мостики», которые в свою очередь крепко удерживают агрегат.(3) Энергия взаимодействия клеток в растворе декстрана коррелирует созначением по модели «обедненного слоя» (рис. 7, зеленая прямая, идущая рядомс зависимостью для декстрана). Это означает, что в отличии от случая в плазмеэнергия взаимодействия клеток в растворе декстрана распределена равномерново всем процессе агрегации.

Физический принцип взаимодействия согласуется смеханизмом «обедненного слоя», т.к. осмотическое давление пропорциональноплощади обедненного слоя. В плазме, напротив, наблюдается другой характервзаимодействия.Тем не менее, как именно белки взаимодействуют друг с другом и сэритроцитом, остается не ясным. Остается открытым вопрос и о том, как приСАЭ преодолевается столь сильное взаимодействие клеток, наблюдаемое приДАЭ.

Особенно, имея ввиду отсутствие эффекта возрастания силы при САЭ иналичие сильного эффекта при ДАЭ.На базе полученных результатов мы можем заключить, что имеющиесямодели не способны описать взаимодействие эритроцитов в нативной среде(плазме). Для описания взаимодействия клеток предлагается расширеннаямодель «подвижных мостиков» и ее комбинация с моделью «обедненного слоя».Тем не менее нельзя исключить возможность того, что САЭ реализуется за счетдругих типов мостиков, которые легко формируются и являютсямалоподвижными.

Таким образом, механизм взаимодействия эритроцитовтребует дальнейшего детального изучения.РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ:Основные результаты диссертационной работы могут бытьсформулированы следующим образом: Показано, что в растворах, содержащих только фибриноген и альбумин,не происходит спонтанной агрегации эритроцитов. Для их агрегации требуетсяналичие в растворе других компонентов крови. При этом эритроциты врастворах белков сильно взаимодействуют друг с другом в пределах площадиперекрытия (контакта), искусственно созданного с помощью лазерныхпинцетов. В сыворотке крови происходит спонтанная агрегация эритроцитов созначительно ослабленными характеристиками силы и скорости, что показываетзначительную роль фибриногена в этом процессе, но только в комплексе сдругими компонентами плазмы крови.22 Показано, что силы, развиваемые при спонтанной агрегацииэритроцитов, значительно меньше сил, необходимых для дезагрегации ужеобразованных агрегатов.

Эти силы также значительно изменяются взависимости от наличия или отсутствия фибриногена, что следует из сравнениясил в плазме и сыворотке. Показано, что сила дезагрегации эритроцитов зависит от площади ихвзаимодействия. В растворах нейтральных макромолекул эта зависимостьсогласуется с моделью «обедненного слоя» и монотонно убывает по мереуменьшения площади взаимодействия. В растворах белков, плазмы и сывороткикрови сила, необходимая для дезагрегации клеток, пропорциональнамаксимальной площади взаимодействия. Показано, что сила взаимодействия эритроцитов достигаетмаксимального значения, если они взаимодействуют дольше, чем 10 секунд. Этонаблюдается для взаимодействия эритроцитов во всех исследованных растворах. На базе простой модели дезагрегации эритроцитов сделана оценкаэнергии их взаимодействия.

Оценка энергии взаимодействия, сделанная поизмерениям, выполненным с помощью лазерных пинцетов, практическисовпадает с теоретическими оценками, известными в литературе. Предложено использование модели «подвижных мостиков» дляописания взаимодействия эритроцитов при их дезагрегации в плазме, сывороткекрови и в растворах белков. Совокупность моделей «подвижных мостиков» и«обедненного слоя» использована для описания всего процесса обратимойагрегации эритроцитов в плазме.СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:Работы, опубликованные соискателем в перечне ведущих рецензируемыхнаучных журналов и изданий, рекомендованных ВАК:1.