Автореферат (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов)

На правах рукописиЛи КисунВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭРИТРОЦИТОВ В СРЕДАХ, ИНДУЦИРУЮЩИХ ИХАГРЕГАЦИЮ: ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНЫХ ПИНЦЕТОВСпециальность 03.01.02 – «Биофизика»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква – 20161Работавыполнена на кафедре общей физики и волновых процессовфизического факультета Московского государственного университета имениМ.В. ЛомоносоваНаучныйруководитель:кандидат физико-математических наук, доцентПриезжев Александр ВасильевичОфициальныеоппоненты:Кириллин Михаил Юрьевич, кандидат физикоматематических наук, старший научный сотрудникФедерального государственного бюджетного научногоучреждения «Федеральный исследовательский центрИнститут прикладной физики Российской академиинаук»Муравьёв Алексей Васильевич, доктор биологическихнаук, профессор кафедры медико-биологических основспорта Федерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшегопрофессионального образования «Ярославскийгосударственный педагогический университет им.

К.Д.Ушинского»Научный центр волновых исследований Федеральногогосударственного бюджетного учреждения наукиИнститута общей физики имени А.М. Прохорова РАНВедущаяорганизация:Защита состоится «19» мая 2016 года в 17-00 на заседании диссертационногосовета Д501.002.11 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 2,физический факультет МГУ, аудитория ЦФА.С диссертацией можно ознакомиться в библиотекегосударственного университета имени М.В.

Ломоносова.Автореферат разослан «Московского» ___________ 2016 года.Ученый секретарьдиссертационного совета Д 501.002.11,кандидат технических наукСидорова Алла Эдуардовна2Общая характеристика работыАктуальность работыСпособность к агрегации является одним из важнейших свойствэритроцитов. Агрегация эритроцитов (АЭ) – это обратимый процессобразования агрегатов эритроцитов. АЭ в значительной мере определяетвязкость крови при низких сдвиговых напряжениях, и, как следствие, еемикроциркуляцию и эффективность доставки кислорода к тканям.

Поэтомуисследование АЭ является важной задачей реологии крови.Исследования АЭ интенсивно проводятся на протяжении несколькихпоследних десятилетий. В основном АЭ изучается в условиях in vitro.Эксперименты по ее изучению в условиях in vivo сложны в реализации и малораспространены. В большинстве случаев исследования АЭ проводят с помощьюанализа сигнала светорассеяния от образца крови в покое или в условияхсдвигового потока и анализа микроскопных изображений.АЭ наблюдается только при наличии в окружающей среде макромолекулплазмы крови, среди которых основную роль играет белок фибриноген, илинекоторых других макромолекул, например, декстранов высокой молекулярноймассы. Степень АЭ зависит от концентрации этих макромолекул.

Роль белковплазмы крови при АЭ подтверждается корреляцией измеряемых параметров АЭс концентрацией белков. Однако до сих пор остается неясным вопрос о том, какименно белки участвуют в АЭ.В экспериментах с использованием растворов отдельных белков дляиндуцирования АЭ наблюдается синергетический эффект разных белков плазмыкрови, например, альбумина с фибриногеном или γ-глобулином. Альбумин, неиндуцирующий АЭ отдельно от других белков, в значительной степениизменяет ее в присутствии фибриногена или γ-глобулина. Синергетическоевлияние на АЭ наблюдается и для неплазменных макромолекул.Известно, что процесс АЭ зависит также от свойств самих эритроцитов.Способность эритроцитов к агрегации называют агрегируемостью эритроцитов.Для разделения вклада среды (плазмы) и свойств самих эритроцитовхарактеристики агрегации изучают в модельных растворах нейтральныхмакромолекул.

Знание агрегируемости эритроцитов особенно важно припатологических состояниях. Агрегируемость эритроцитов может значительноизменяться при патологиях, в то время как АЭ в плазме может практически не3изменится. Таким образом, агрегируемость эритроцитов служит индикаторомизменений свойств самих эритроцитов.Наиболее широко АЭ изучена в растворах синтетических нейтральныхмакромолекул. Для описания взаимодействия эритроцитов при агрегации врастворах макромолекул используют две модели. Первая - модель «мостиков»(«cross-bridges») - описывает взаимодействие эритроцитов образованием связеймежду ними за счет адсорбции макромолекул на мембранах соседних клеток.Агрегация происходит за счет сил связывания макромолекул.

Вторая - модель«обедненного слоя» («depletion layer») - описывает прижимание эритроцитовдруг к другу за счет возникающих осмотических сил (осмотического давления).Эти модели все еще не получили согласованную экспериментальнуюпроверку. Более того, остается неизвестной применимость разработанныхмоделей для нативной среды (плазмы).

Таким образом, до сих пор нет модели,которая полностью описывала бы взаимодействие клеток при их агрегации.Отсутствие такой модели в большой степени связано с недостатком ключевыхэкспериментальных данных, которые можно получить только прямымизмерением параметров взаимодействия эритроцитов.Лазерный пинцет является одним из тех средств, которые могут бытьиспользованы для получения необходимых экспериментальных данных.Изобретение лазерного пинцета (ЛП) способствовало прорыву в исследованияхв области биофизики. Появилась возможность измерять силы взаимодействияотдельных клеток и макромолекул с точностью до долей пиконьютонов (пН).

Вряде работ ЛП использовался для изучения взаимодействия эритроцитов при ихагрегации. Были получены данные о динамике взаимодействия клеток, которыедо этого были неизвестны. Тем не менее, систематического изучения агрегацииэритроцитов данным методом еще не проводилось.Таким образом, к началу выполнения диссертационной работы не были доконца изучены механизмы взаимодействия эритроцитов при их агрегации втаких близких к нативным средах, как плазма и сыворотка крови, растворыбелков крови. Не ясна была роль отдельных белков и их комплексов в АЭ.

Несуществовало данных сравнения агрегации эритроцитов в модельных растворахнейтральных макромолекул и в нативных средах.Диссертационная работа посвящена изучению биофизики взаимодействияэритроцитов в процессе их обратимой агрегации. Параметры, характеризующиевзаимодействие эритроцитов при их агрегации между собой, измерялись спомощью лазерных пинцетов in vitro.4В данной работе ЛП использован для систематического изучениявзаимодействия эритроцитов при их агрегации и дезагрегации в зависимости отсостава среды, в которой находятся клетки. Измерения сил взаимодействиябыли проведены в аутологичной плазме и сыворотке крови, в модельныхрастворах белков плазмы крови (фибриногена и альбумина) и нейтральныхмакромолекул (декстрана с м.м.

500 кДа и 70 кДа). Проведен анализ результатовизмерения, сделана оценка их согласованности с существующими моделямивзаимодействия эритроцитов. Было развито представление о взаимодействииэритроцитов при их агрегации посредством образования подвижных мостиков.Целью работы является изучение механизмов взаимодействия отдельныхэритроцитов при их агрегации и дезагрегации с использованием лазерныхпинцетов и выявление роли отдельных макромолекул среды в этом процессе.Достоверность, полученных в работе результатов подтверждается ихсогласованностью с данными экспериментов, проведенных в нашейлаборатории с помощью других методов изучения АЭ; соответствиемрезультатов теоретическим оценкам, приведенным как в литературе, так и вдиссертационной работе; соответствием экспериментальных результатов сданными, опубликованными в работах других авторов.

Результатыисследований были апробированы и представлены более, чем на десятимеждународных конференциях, обсуждены на нескольких профильныхсеминарах.Результатыдиссертационнойработыопубликованыврецензируемых журналах из списка ВАК. Представленные результаты являютсяновыми и получены впервые.Научная новизна работыРазработана новая методика измерения с помощью лазерных пинцетов силывзаимодействия между двумя эритроцитами при их агрегации в различныхсредах: растворах белков плазмы крови и нейтральных макромолекул(декстранов), а также в цельной плазме и сыворотке крови.

При этом:1. Впервые обнаружено значительное отличие между силой, развиваемой приспонтанной агрегации пары эритроцитов, и силой, необходимой длядезагрегации парного агрегата эритроцитов, при разных составах окружающейсреды.2. Предложена новая гипотетическая модель для описания полученныхэкспериментальных данных по взаимодействию пары эритроцитов при ихагрегации в различных растворах.53. Впервые сделано сравнение параметров процесса агрегации эритроцитов,измеренных в образцах цельной крови и на уровне отдельных клеток.4.

Впервые проведено исследование зависимости динамики взаимодействияпары эритроцитов в различных растворах от длительности и площади ихвзаимодействия. Показаны особенности взаимодействия, характерные дляразличных растворов.Научная и практическая значимостьПрименение разработанной методики измерения сил взаимодействияэритроцитов человека с помощью лазерных пинцетов позволит продвинуться висследовании биофизических механизмов агрегации эритроцитов как в норме,так и при различных заболеваниях.1. Разработанная методика измерения сил взаимодействия эритроцитов можетбыть применена для исследования физических закономерностей взаимодействиядругих живых клеток.2.

Разработанная методика измерения сил взаимодействия эритроцитов можетбыть эффективно использованы для исследования связи микрореологическихсвойств эритроцитов с параметрами микроциркуляции крови человека и малыхлабораторных животных в норме и при различных патологиях.3.Полученные в работе новые данные о характере взаимодействия эритроцитовна уровне одиночных клеток могут быть использованы для разработки новыхбиофизических моделей взаимодействия живых клеток.Положения, выносимые на защиту1. Спонтанная агрегация двух одиночных эритроцитов с образованием парногоагрегата не происходит в растворах, содержащих только молекулы альбуминаили только молекулы фибриногена вплоть до концентрации двойнепревышающей физиологическую норму.2. Значительная роль фибриногена в процессе спонтанной агрегацииэритроцитов проявляется только в совокупности с другими компонентамикрови.3. Спонтанная агрегация эритроцитов (САЭ) и дезагрегация эритроцитов (ДАЭ)в плазме не являются абсолютно обратными процессами.