Автореферат (1102495), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Сила взаимодействияэритроцитов при САЭ уменьшается пропорционально площади взаимодействияэритроцитов. При ДАЭ она, напротив, возрастает по мере разделения клеток.4. Процесс взаимодействия клеток в плазме и сыворотке отличается от того, чтонаблюдается в модельных растворах нейтральных макромолекул. В растворахнейтральных макромолекул силы взаимодействия клеток как при спонтанной6агрегации, так и при дезагрегации уменьшаются пропорционально площадивзаимодействия.5.
Модель «подвижных мостиков» применима для описания взаимодействияэритроцитов в плазме. Возрастание энергии взаимодействия клеток по мере ихразделения описывается подвижностью связей (мостиков) и их аккумуляцией.6. Энергия взаимодействия эритроцитов в растворе декстрана остаетсяпостоянной по мере их разделения.Личный вклад диссертанта заключается в построении автоматизированнойустановки, включающей два независимо управляемых лазерных пинцета исистему компьютерной обработки данных, разработке методики и протоколаизмерения силы взаимодействия клеток, проведении экспериментов, обработкии интерпретации данных экспериментов, организации сбора крови и подготовкиобразцов, пригодных для проведения измерений.Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывалисьна следующих международных конференциях: «15th International Congress ofBiorheology and 8th International Conference on Clinical Hemorheology» (Сеул,Корея, 2015), «Ломоносов – 2015» (Москва, Россия, 2015), «Laser Applications inLife Science» (Ульм, Германия, 2014), «Ломоносов – 2014» (Москва, Россия,2014), «Saratov Fall Meeting 2014» (Саратов, Россия, 2014), «Russian Photonicsand Laser Symposium 2014» (Куопио, Финляндия, 2013), «Saratov Fall Meeting2013» (Саратов, Россия, 2013), «Topical Problems of Biophotonics 2013» (НижнийНовгород, Россия, 2013), «Hemorheology and Microcirculation« (Ярославль,Россия, 2013), «Оптические методы исследования потоков» (Москва, Россия,2013), «Russia-Taiwan School-Seminar on Nonlinear Optics and Photonics»(Владимир, Россия, 2013), “Photonics and Imaging in Biology and Medicine”(Ухань, Китай, 2013), «Ломоносов – 2013» (Москва, Россия, 2013), «Saratov FallMeeting 2012» (Саратов, Россия, 2012), «IV Съезд Биофизиков России» (НижнийНовгород, Россия, 2012), «Ломоносов – 2012» (Москва, Россия, 2012)Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 3-х статьях вмеждународных научных изданиях и журналах из списка ВАК России.Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, 4 глав,заключения и списка цитируемой литературы из 143 наименований. Работаизложена на 96 страницах машинописного текста и включает 36 рисунк и 2таблицы.7СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫГлава 1. Обзор литературыВ первой главе приводится литературный обзор, посвященный АЭ и методам ееисследования. Дано описание процесса АЭ и ее роли в реологии крови. Описаныусловия, при которых происходит процесс АЭ, факторы, изменяющие степеньАЭ, представлены существующие модели взаимодействия эритроцитов приагрегации.Глава 2. Материалы и методыВо второй главе описана процедура подготовки экспериментальных образцов,использовавшихся в работе, экспериментальная установка и принцип ее работы,процедураизмеренияпараметров,характеризующихвзаимодействиеэритроцитов, и процедура обработки и анализа полученных данных.В работе использовалась кровь нескольких условно здоровых волонтеров.Все эксперименты проводились in vitro.
Кровь для экспериментов забиралась излоктевой вены или из пальца. Измерения проводились в течение несколькихчасов после взятия крови. В качестве антикоагулянта использовался ЭДТА(этилендиаминтетрауксусная кислота). Аутологичная плазма и сыворотка кровиотделялись по стандартному протоколу из цельной крови и хранились притемпературе -20°С не более одной недели.В работе изучалось взаимодействие эритроцитов в следующих растворах: (1)аутологичной плазме и (2) аутологичной сыворотке, (3) растворах белковплазмы крови фибриногена и альбумина как по отдельности, так и всовокупности, и (4) в растворе декстрана 500 кДа. Такой выбор белков былобусловлен тем, что фибриноген является одним из основных белков,определяющих реологию крови, и наблюдается синергетический эффектальбумина с фибриногеном.
Взаимодействие эритроцитов в растворе декстранаизучалось как пример взаимодействия в растворе нейтральных макромолекул.Малый объем цельной крови, взятой из вены (порядка 10 мл) или из пальца(порядка 20 мкл), сразу помещался в фосфат-буферный раствор, где эритроцитыотмывались по стандартной процедуре. Затем эритроциты добавлялись всоответствующую среду.
Объемная концентрация эритроцитов в образце былапорядка 0.5%, что давало возможность свободно манипулировать отдельнымиклетками с помощью лазерных пинцетов (ЛП).Дляэкспериментальногоизучениявзаимодействияэритроцитовиспользовалась собранная нами установка из 2-х независимых ЛП на основе8одномодовых инфракрасных Nd:YAG лазеров (1064 нм, 200 мВт).
Пучкилазеров фокусировались водоиммерсионным объективом с числовой апертуройNA = 1.00. Нагревом эритроцита под действием лазерного излучения можнобыло пренебречь в силу того, что длина волны лазерного излучения приходитсяна окно прозрачности крови, а также имеется эффективный теплоотвод за счетсуспендирующей среды.
Наши расчеты, проведенные для оценки нагреваэритроцитов, показали, что при использованной нами фокусировке пучка накаждые 10 мВт мощности лазерного излучения приходится нагрев эритроцитана 1-2°С в течение 5 минут. Эта оценка соответствует литературным данным.Проведенные нами дополнительные эксперименты показали, что при удержанииэритроцита в ЛП в течение 10-ти минут при мощности пучков после объектива,не превышающей 30 мВт, ни форма эритроцита, ни его размеры, равно как иникакие другие наблюдаемые параметры не изменялись. В то же время в нашихэкспериментах среднее время контакта лазерного пучка с указанной мощностьюс клеткой, как правило, не превышало 3-5 минут.Для проведения экспериментов с ЛП изготавливались одноразовые кюветы,состоящия из двух покровных стекол, разделенных двухсторонней клейкойлентой.
В случае работы с образцами, не содержащими альбумин, поверхностьстекла обрабатывалась 1% раствором альбумина в фосфат-буферном растворе ивысушивалась. Таким образом, предотвращалось прилипание эритроцитов кповерхности стекла. В кювету помещалось порядка 50 мкл образца.Для измерения сил взаимодействия с помощью ЛП периодическипроводилась их калибровка в следующей последовательности.
Эритроцитзахватывался с помощью ЛП и поднимался со дна кюветы на определеннуювысоту. Затем относительно захваченного за один край эритроцита создавалсярегулируемый поток жидкости. Под действием сил вязкого трения эритроцитвытягивался и приобретал форму, близкую к эллипсоидальной. Скорость потокаувеличивалась до тех пор, пока сила вязкого трения не превышала силу захватаЛП при определенной мощности лазерного излучения.
Эта сила рассчитываласьпо формуле Стокса, модифицированной для эллипсоидальных частиц (1). Путемсопоставления рассчитанной силы вязкого трения и силы захвата ЛП на моментотрыва эритроцита, находилась эффективность захвата Q, сопоставленная смощностью ЛП по формуле (2). Более подробно процесс калибровки изложен вовторой главе диссертации.
= 6,(1)9=4 2( − 1)31(2 2 − 1)ln [ + ( 2 − 1)2 ] − 21/2( − 1)где – динамическая вязкость внешней среды, r – радиус сечения захваченнойчастицы, – скорость потока, – отношение полуосей эллипсоида, K –поправочный коэффициент для эллипсоида=(2)где Q – эффективность захвата, n – показатель преломления внешней среды, P –мощность лазерного излучения, с – скорость света в вакууме.Эксперименты проводились на агрегатах, состоящих из двух эритроцитов.Измерялось несколько параметров, характеризующих взаимодействиеэритроцитов.
Параметры разделялись на две группы: первая группа относилась кизмерениям параметров спонтанной АЭ, как процесса самопроизвольногонаползания эритроцитов друг на друга после образования локального контакта.Вторая группа относилась к параметрам дезагрегации эритроцитов, как процессаискусственного разъединения эритроцитов. В нашей работе мы ограничивалисьпарным взаимодействием эритроцитов.Измерения параметров проводились в сумме более, чем на 2,000 парахэритроцитов. При этом для выполнения одной серии измерений на 10-20 парахэритроцитов при фиксированных условиях, включая все подготовительные итехнические процедуры, затрачивалось 3-5 часов.
Результаты экспериментовусреднялись по измерениям на эритроцитах крови нескольких доноров и,следовательно, на нескольких десятках пар эритроцитов. Основной вклад впогрешностьполученныхрезультатов(разбросзначений)вносилоиндивидуальное отличие эритроцитов друг от друга.Глава 3. Измерение параметров агрегации эритроцитов с помощьюлазерного пинцетаВ третьей главе описаны методика и результаты измерений динамикивзаимодействия эритроцитов при их спонтанной агрегации.
Приведеносравнение полученных результатов с литературой, обсуждение и выводы.3.1. Измерение параметров спонтанной агрегации эритроцитовВ данном разделе описаны результаты исследования параметров спонтаннойагрегации эритроцитов. Изучался процесс, при котором два эритроцита10самопроизвольно «наползают» друг на друга без влияния сторонних сил послеобразования локального контакта. Измерялись следующие параметры:(1) скорость спонтанной агрегации эритроцитов (VA) - это скорость«наползания» эритроцитов друг на друга после образования локальногоконтакта.(2) сила при спонтанной агрегации эритроцитов (FA) – это латеральная сила,с которой эритроциты действуют друг на друга при «наползании».На рис.
1 (а) и (б) схематически показана процедура измерения VA, состоящаяиз следующих этапов: (1) два невзаимодействующих эритроцита захватывалисьдвумя независимыми ЛП; (2) эти эритроциты сводились до площади перекрытияпорядка S ≈ 10 мкм2 и удерживающие эритроциты пучки ЛП отключались; (3)эритроциты самопроизвольно «наползали» друг на друга со скоростью,зависящей от внешней среды.
Скорость VA измерялась как отношение линейногоперекрытия эритроцитов ко времени. Скорость была практически постоянной втечение всего процесса «наползания». На рис. 1 (в) приведена зависимостьплощади перекрытия эритроцитов от времени. При этом исключались несколькопервых секунд до начала «наползания», когда эритроциты практическинеподвижны, а также торможение «наползания» эритроцитов после практическиполного перекрытия их боковых поверхностей. Результаты измерений для всехисследованных растворов представлены на рис.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
