Автореферат (1102495), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Характерные скорости: VA =0.34 ± 0.18 мкм/с (плазма), VA = 0.17 ± 0.15 мкм/с (сыворотка), VA = 0.34 ± 0.18мкм/с (декстран) мкм/с. В растворах белков фибриногена и альбумина как поотдельности, так и в совокупности САЭ не происходила и VA = 0.Измерение силы FA при спонтанной агрегации эритроцитов проводилосьпоэтапно так, как показано на рис.
3 (а): (1) два эритроцита захватывались двумяЛП; (2) эти эритроциты сводились до определенного перекрытия их боковыхповерхностей и удерживались; (3) затем сила захвата FTRAP постепенноуменьшалась до тех пор, пока FA не превысит ее.11Рис. 1. (а-б) Схема процедуры измерения скорости спонтанной агрегации эритроцитов.Крестиками отмечены положения ЛП. Два эритроцита сводятся до локального контакта иотпускаются, после чего они самопроизвольно «наползают» друг на друга или нет взависимости от состава среды: (а) в аутологичной плазме, сыворотке и в растворедекстрана САЭ происходит; (б) в белковых растворах САЭ не происходит.
(в)Зависимость скорости САЭ в плазме от линейного перекрытия эритроцитов от времени.Результаты измерений, представленные на рис. 3 (б), показывают, что вплазме FA = 1.5 ± 0.5 пН и 4.5 пН ± 1.4 пН для площадей взаимодействияэритроцитов S = 10.3 ± 1.1 мкм2 и 20.7 ± 2.2 мкм2 мкм соответственно. Такимобразом, FA растет при увеличении S.
Изучение временной зависимости FA длявремен взаимодействия от 10 до 100 секунд показало, что силы взаимодействияпрактически не изменяются (см. рис. 3 (в)). В других растворах измеренияпроводились только для одного значения S. В растворе декстрана (500 кДа, 5мг/мл) FA = 1.8 ± 0.5 пН для S = 19.1 ± 4.4 мкм2. В сыворотке FA = 0.8 ± 0.4 пНдля S = 14.7 ± 3.4 мкм2.Значения FA и VA сильно зависят от состава среды. В сыворотке посравнению с плазмой крови наблюдается замедленная и ослабленная агрегация,что показывает роль фибриногена в процессе САЭ. Тем не менее, в модельныхрастворах фибриноген ни сам по себе, ни в совокупности с альбумином невызывает САЭ.
Следовательно в процессе САЭ ключевую роль играетсинергетический эффект фибриногена с другими компонентами крови. Более12того, для индуцирования САЭ недостаточно наличия только белковфибриногена и альбумина. Следует учесть, что помимо фибриногена известнопорядка 10 белков, которые также влияют на АЭ. Также нельзя исключатьвозможность того, что имеются компоненты плазмы крови, которые несчитаются сами по себе ни проагрегантами, ни ингибиторами, как альбумин, нов совокупности могут изменять агрегационные параметры. Таким образом,можно заключить, что даже инициация САЭ – это комплексный процесс,который еще требует детального изучения. Ключевая роль фибриногена, покрайней мере в САЭ, проявляется только в комплексе с другими компонентамиплазмы крови.Рис. 2.
Результаты измерений скорости спонтанной агрегации эритроцитов. Разнымицветами отмечены среды, в которой проводилось измерение.В растворах нейтральных макромолекул наблюдается САЭ, сравнимая с той,что происходит в плазме и сыворотке крови. Таким образом, судя только поизмерениям параметров САЭ, характер взаимодействия эритроцитов в плазме ив растворах нейтральных макромолекул совпадает. Однако, как показано далеепо измерениям параметров ДАЭ, взаимодействие клеток в растворахнейтральных макромолекул и в плазме значительно отличается.133.2.
Измерение параметров дезагрегации эритроцитовПараметры ДАЭ измерялись в процесс разделения с помощью ЛП клеток вискусственно образованном агрегате, состоящем из двух эритроцитов. Дваэритроцита соединяли с помощью ЛП в агрегат и измеряли силу, которуюнужно приложить для его дезагрегации FD. Сила дезагрегации – это сила,необходимая для полного или частичного разделения эритроцитов. Она былаизмерена в зависимости от площади перекрытия и времени взаимодействияэритроцитов.
Следует отметить, что эритроциты в растворах белков сильновзаимодействуют друг с другом в пределах искусственно созданной площадивзаимодействия, несмотря на отсутствие САЭ. Характерные силы, необходимыедля разделения эритроцитов, сопоставимы с силами в плазме крови при схожейконцентрации изучаемых белков (фибриноген и альбумин).Рис. 3 (а). Схема процедуры измерения силы при спонтанной агрегации эритроцитов - FA.Крестиками отмечены положения ЛП. Стрелками отмечены направления сил. (б)Результаты измерений F A(S) в плазме, наблюдается увеличение силы взаимодействияклеток вместе с площадью взаимодействия клеток. (в) Временная зависимость FA вплазме и в растворе декстрана.Процедура измерения силы FD в зависимости от временивзаимодействия эритроцитов показана по этапам на рис.
4 (а): (1) два одиночных14невзаимодействующих эритроцита захватывались двумя независимыми ЛП; (2)эритроциты сводились до перекрытия порядка 10 мкм 2 и удерживались вконтакте от 10 до 100 секунд; (3) эритроциты разводились с помощью ЛП дополной дезагрегации. Поэтапно увеличивая силу захвата FTRAP с маленькимшагом (~0.5 пН), определяли минимальную силу, при которой эритроцитыполностью дезагрегируют. Результаты измерения, представленные на рис.
4 (б),показывают, что FD эритроцитов практически не изменяется со временем вовсех исследуемых средах.При дезагрегации эритроцитов в плазме мы наблюдали, что по мере ихразделения нужно увеличивать прилагаемую силу. Этосогласуется срезультатами, полученными другими авторами. В то же время в растворедекстрана наблюдался противоположный эффект: клетки разделялисьполностью без увеличения силы. Для количественной оценки и сравнениянаблюдаемой разницы мы измерили зависимость сил при дезагрегацииэритроцитов от смещения эритроцитов, как показано на рис.
5 (а). Процедураэксперимента была следующая: сначала два одиночных невзаимодействующихэритроцита захватывались двумя независимыми ЛП. Затем эти эритроцитысводились до перекрытия боковых поверхностей порядка 30 мкм2 иудерживались в контакте более 10 секунд.
Затем эритроциты разводили путемпередвижения одного из ЛП с постоянной скоростью около 0.1 мкм/с до тех пор,пока сила взаимодействия клеток (или сила дезагрегации эритроцитов) непревысит силу захвата ЛП. Далее процесс повторялся при увеличении силыFTRAP. Таким образом, получалась зависимость сил взаимодействия эритроцитовпри дезагрегации от их относительного смещения.
В случае измерения врастворе декстрана вместо увеличения силы взаимодействия эта силауменьшалась по мере разделения клеток и, как показано на рис. 5 (б), всегдаудавалось окончательно разделять клетки.Представленные на рис. 5 (б) результаты измерений показывают, что врастворах белков, плазме и сыворотке крови по мере разделения эритроцитовсила их взаимодействия возрастает, и для достижения большего относительногосмещения клеток требуется большая сила. Абсолютная величина силы FA вплазме и сыворотке почти на один порядок меньше, чем сила FD. В случаеизмерения в растворе декстрана наблюдалось наоборот уменьшение силы,необходимой для разделения эритроцитов.
В то же время в растворе декстранадля ДАЭ и САЭ зависимости совпадают, хотя FD > FA примерно в 2 раза.15Рис. 4. (а) Схема процедуры измерения силы дезагрегации. Крестиками отмеченыположения ЛП. Два эритроцита сводятся и удерживаются в контакте в течениенекоторого времени (10-100 секунд). Затем измеряется сила, необходимая для их полногоразъединения (FD). (б) Из результатов измерения видно, что с хорошей точностью можносчитать, что FD(t) = const.Экспериментальные результаты показывают, что эритроциты врастворах белков, хотя и не агрегируют спонтанно, но сильно взаимодействуютдруг с другом, будучи подведенными в контакт с помощью ЛП.
Для растворабелков, плазмы и сыворотки крови наблюдается эффект возрастания силывзаимодействия по мере разделения клеток. Следует отметить, что для процессаСАЭ в плазме сила FA уменьшается пропорционально уменьшению площадивзаимодействия эритроцитов и эффект возрастания силы не наблюдается. Врастворах же нейтральных макромолекул наблюдается одинаковая зависимостькак для САЭ, так и для ДАЭ и эффект возрастания силы также не наблюдается.Результаты измерений временной зависимости силы при спонтаннойагрегации и дезагрегации эритроцитов показали, что для характерных времен от10 до 100 секунд изменений силы нет.
По литературным данным результаты,полученные с помощью лазерных пинцетов для плазмы и с помощью атомногосилового микроскопа для раствора декстрана, показывают, что силывзаимодействия эритроцитов резко возрастают течение первых 5 секундконтакта. Однако результаты дальнейших измерений имеют значительныйразброс и являются недостоверными. В то же время наши результаты наглядно16показывают, что сила взаимодействия эритроцитов насыщается уже попрошествии первых 10 секунд взаимодействия клеток. В плазме такженаблюдается отличие абсолютных величин чт FA и FD почти на один порядок.Это может означать, что природа сил, собирающих эритроциты в агрегат (FA) иудерживающих агрегат от разрушения (FD) отличается. Более детальномуобсуждению полученных данных в свете механизмов взаимодействияэритроцитов посвящена глава 4.Рис.
5. (а) Схема процедуры измерения зависимости сил взаимодействия эритроцитовпри дезагрегации от относительного смещения клеток. Крестиками отмечены положенияЛП. Два эритроцита сводятся до перекрытия боковых поверхностей порядка 30 мкм 2 (A ≈5-6 мкм). Один из эритроцитов оттягивается от другого до тех пор, пока силавзаимодействия клеток не превысит силу захвата ЛП и эритроцит не выскочит из ЛП.Процедура повторяется с пошагово с нарастающей силой.
(б) Зависимость силыдезагрегации FD от смещения эритроцитов. Символы, относящиеся к растворам разныхбелков и к плазме, в которых были проведены измерения, отмечены разными цветами.Смещение рассчитывалось как ∆Si/S0, где S0 – начальная площадь взаимодействияэритроцитов; Si – площадь взаимодействия эритроцитов на момент отрыва эритроцита изЛП при каждой из приложенных сил.Глава 4. Механизм взаимодействия эритроцитов при их агрегацииДанная глава посвящена оценке энергии взаимодействия эритроцитов при ихспонтанной агрегации и дезагрегации и развитию представлений обиофизических моделях, описывающих механизм взаимодействия эритроцитов.17Показано, что в растворах нейтральных макромолекул этот процесс может бытьописан в рамках представлений, приведенных в литературе.
Напротив,взаимодействие эритроцитов в плазме противоречит им. Предлагаетсярасширенная модель «мостиков» - модель «подвижных мостиков». Комбинациямоделей «обедненного слоя» и «подвижных мостиков» предлагается дляописания всего процесса обратимой агрегации эритроцитов в плазме.Модели взаимодействия эритроцитов, представленные в литературе,сталкиваются с трудностями при интерпретации экспериментальных данных.Случай пропорциональности силы взаимодействия и площади взаимодействияэритроцитов может описываться обеими моделями: для модели «мостиков»плотность точек связывания макромолекул пропорциональна площадивзаимодействия эритроцитов; для модели «обедненного слоя» осмотическиесилы пропорциональны площади образованного обедненного слоя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
