отзыв официального оппонента доктора физико-математических наук Быстрова В.С. (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования)

отзыв официального оппонента иа диссертационную работу Толстовой Анны Павловны "Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования", представленной на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.01.02 - "Биофизика" Пространственная структура белков и различных белковых комплексов является объектом пристального внимания ученых как в области структурной и молекулярной биологии, так и биоинженсрии и биоинфорчатики. Актуальность этой проблемы определяется и ее фундаментальным значенисм для нашего познания природы белков, а также ее огромным практическим значением для фармакологии и биомедицины.

Применение компьютерного моделирования, особенно методов молекулярной динамики„ позволили достичь существенного прогресса в изучении белковь|х структур и их копформациопных изменений, в теоретическом понимании происходящих процессов. Однако, тут не все удается успешно промоделировать. Известно, гго для такого моделирования необходимы исходные данные по позициям всех атомов, получаемые экспериментальными методами: ренат ецоструктурпым анализом, и др. При этом не всегда удается достаточно хорошо идентифицировать позиции атомов, например, в подвижных частях молекул. а также протонов. Поэтому тут возникают пробелы в структуре молекул. которые необходимо восстановить.

Существуют разные способы. позволяющие это делать и сочетающие методы компьютерного моделирования, и экспериментальные подходы. Развитие современной техники атомно-силовой микроскопии позволяет изучать такие структуры. конформационные особенности белков в режиме реального времени н и пи о. Диссертационная работа Толстовой Л.П. как раз и относится к этому важному новому научному направлению и посвящена анализу данных атомно-силовой микроскопии белков, имеющих псструктурированныс участки, с помощью компьютерного моделирования методом молекулярной динамики.

Изучение структуры таких белков явлмеигся акпа'альмой задачей' компьютерного моделирования в молекулярной биологии„так как их полная трехмерная структура пе может быть получена только экспериментальными методами. Толстова А.П. успешно проводит исследование конфорчационных преобразований двух таких белков: фибрнногена человека и аз -субьединицы РНК-полимеразы ЕясЬепсл1а со11, комбинируя методы молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии. Кроме того, на примере лизоцича из белка куриного яйца она развивает и показывает новый способ непосредственного сравнения результатов атомно-силовой микроскопии исследуемой молекулы и результатов моделирования методами молекулярной динамики процесса адсорбции белка, на поверхность используечой в эксперименте подложки.

Толстова А.П. предложила привести структуру белка, полученную в моделировании, к виду топологии поверхности, получаемой в атомно-силовой микроскопии (АСМ). Это позволяет количественно сравнивать размеры полученных объектов и судить об их сходстве. а пгкжс расположении недосикицих частей модели, 'Это является несомненным самос гоятельным достижением диссертанта.

Диссертационная работа представлена на ! 30 страницах. состоит из введения. трех глав с изложением результатов, включая 3" рисунка и 11 таблиц, и заключения. а также списка цитируемой литературы из 151 наименований. Во введении описаны методы исследования и их недоста~ки, обуславливаю~дне актуальность исследования, поставлены цель и задачи исследования, показаны научная значимость и новизна работы, перечислены публикации по теме диссертации а также конференции, на которых бьши представлены результаты диссертации. Г!ервая глава посвящена анализу состояния молекулярной биологии по данной проблеме на текущий момен г и заканчивается постановкой задачи диссертационного исследования.

Вторая глава посвящена теоретическим аспектам применимости молекулярной динамики к трактовке ланных атомно-силовой микроскопии белков с неструктурированными участками. В первом разделе проведен анализ возможности уточнять трехмерные структуры белков, полученные методом рентгено-структурного анализа, с помощью энергетической минимизации. Толстова А.П. показала. что в настоящее время в целом зто невозможно.

поэтому требуется привлекать другие методы для уточнения данных молекулярной динамики. Анализируя различные данные, Толстова А.П.. в итоге, построила модели некозо!зых часто используемых в атомно-силовой микроскопии подложек для дальнейшего проведения адсорбции белков на эти поверхности. Толстова А.П. также достроила недостающие участки трехмерной структуры белка ст"-субъедипицы РНКП Есой и показала продуктивность сравнения полученных данных с результатами биохимических методов исследования этого белка.

Ото весьма глубоко проработанная часть диссертации. Она демонстрирует широту проведенного анализа и четкость понимания автором сути исследуемых проблем. '1'рстья ~лава посвящена описанию результатов компьютерных и атомно-силовых экспериментов. выбранных для исследования белков. В ней описаны модели таких белковых структур, как фиориллы п~ -субъедгп~ицы РНКП Е.со!1, адсорбироваппых из молекул фибриногена человека.

и лизоцима. из белка куриного яйца„помещенные на поверхности подложки их оксида кремния. а также и на другие подложки. Проведено сравнение данных компьютерного моделирования и атомно-силовой микроскопии. Анализируются недостатки и возможности методов. Отмечается, в часпюсти. существующие в настоящий момент ограничения точности обоих подходов. Важно, что в итоге автором показано, что результаты проведенного в работе моделирования и экспериментальных данных. полученных методом АСМ. согласуются между собой. В заключении автор перечисляет основные результа~ы и выводы диссертации. Полученные выводы диссертации достагочно обоснованы. '!'ем не менее, при обн!ей высокой оценке диссертационной работы тут имеется ряд замечаний и вопросов к дисссрзанзу.

Так. например, на стр. 32-35 автор описывает принципы атомно-силовой микроскопии и при этом обосновывает преимущества наблюдения биологических молекул в жидкой среде..'йто правильно, высушивание изменяет структуру белка. Но тут возникает вопрос: а как может повлиять проводимость и поляризация жидкости на результаты измерений". Не будет ли тут паразитных токов и других помех? Как можно избежать этих факторов? Далее, на стр. 67-70, анализируется строение и параметризация силовых полей, необходимых для проведения моделирования и расчетов в среде Огогпасз. 1'1ри этом автор справедливо, еще в 1-й главе, обосновал необходимость дополнительной параметризации, а здесь ею было развита, проведена и описана такая параметризация ряда исследуемых структур. Однако, как пишет автор, количество описанных в силовом поле атомов, не равно количеству соответствующих им химических элементов.

Так, например, атом углерода может иметь несколько десятков различных записей. Вопрос тогда возникает: как автор выбирал их в своих расчетах? Также интересно, как именно и на каком основании выбирались автором параметры силовых полей для вводимых дополнительных парамс-гризаций? Например, для заряда атома? Известно ведь, что при квантовых расчетах «эффективный» заряд атома все время частично изменяется при малейшем изменении конфигурации системы. А здесь, выбирается некоторый фиксированный «эффективный» заряд, который должен наиболее оптимально описывать атом в данном приближении. Так как именно выбирались тут параметры для файлов силовых полей? Отметим также дальше„что разработанная методика анализа результатов зондового сканирования на основе предложенной модели весьма интересна и успешно применена автором. Однако, в ее описании на стр.

102, есть некоторая неточность. Так, в используемой там формуле для оценки высоты белка методом АСМ над поверхностью подложки, используется величина, определяемая параметром кгь Тем не менее, сам этот параметр там не определен. Тут необходимо дополнить это описание. Есть также некоторые незначительные недостатки оформления. Так, на стр. 31, 83, 88, 97, 108 — не хватает пробелов, на стр.68 есть опечатка (в слове кое(э)ффицненты). Отмеченные недостатки не умаляют общей высокой положительной оценки диссертации Толстовой А.!1., являющейся законченной на чно-квали икационной работгойй. Несмотря на указанные замечания, работа заслуживает самой высокой оценки и достове ность полученных ез льтатов весьма~бе ительна.

Все основные выводыработы вполне соответствуют полученным данным. Материалы диссертации были представлены и апробированы на ряде Российских и международных конференциях и отражены в 15 публикациях автора, в т.ч. в 2 статьях в рецензируемых научных журналах и 1-й публикации в сборнике трудов. Автореферат достаточно полно отражает все основные положения диссертации. Проведенный анализ данной диссертационной работы показывает, что '1'олстова А.П.

является уже вполне сложившимся исследователем, достаточно адекватно умеюгцим самостоятельно анализировать и решать сложные научные задачи, как в области молекулярной биофизики, так и в компьютерном моделировании и расчетах методамн молекулярной динамики и другими методами. И что особенно интересно и ценно, сочетать эти подходы с экспериментальными данными, получаемыми современными методами ЛСМ. Такое совмещение подходов на стыке разных теоретических и экспериментальных методов можно только приветствовать.

В настоящее время именно такие междисциплинарные исследования и способны существенно продвинуть нас в понимании явлений природы и в успешном применении полученных новых знаний на практике, как в технологиях, так и в медицине. Научная новизна результатов, полученных в диссертационной работе ФИО, определяется впервые представленными теоретическими и экспериментальными исследованиями, а именно: - впервые построены молекулярные модели агрегатов ранних стадий (протофибрилл) о70-субъединицы РНК полимеразы Е.сой, и впервые показано соответствие их размеров с экспериментальными данными АСМ, - также впервые проведено моделирование адсорбции фибриногена на поверхности свежесколотой слюды и слюды, покрытой ГМДС, значимые для АСМ наблюдений, построена модель адсорбции лизоцима на поверхность слюды, полученные характерные размеры моделей хорошо согласовываются с данными проведенных АСМ наблюдений, - впервые проведен сравнительный анализ данных АСМ и МД достроенных белков с использованием методов предсказания структуры отсутствующих фрагментов белков, на основе данного метода была построена близкая к нативной структура белка о70- субъединицы РНК полимеразы Е.сой при разных уровнях ионной силы раствора.