Отзыв официального оппонента - 2 (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля)

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертационную работу Зверевой Ирины Олеговны «ПРОГНОЗИРОВАНИЕ МЕТАБОЛИТОВ РИЛИЗИНГПЕПТИДОВ ГОРМОНА РОСТА В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДИКИ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЦЕЛЯХ АНТИДОПИНГОВОГО КОНТРОЛЯ» на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальностям 02.00.10 — бноорганическая химия 02.00.02 — аналитическая химия официальный оппонент: Савельева Елена Игоревна, доктор химических наук, заведующая лабораторией аналитической токсикологии Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агентства (ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России), 188 663, Ленинградская область, Всеволожский район, г,п.

Кузьмоловский, ст. Капитолово, кори. №93, е-та(1: за«е11еча®ПЬорйе.гп, т/факс (812) 449- 61-77 доб.240 Рилизинг-пептиды гормона роста (ОНКР) широко рекламируются в качестве препаратов для повышения спортивных результатов. Их привлекательность преимущественно связана с трудностью (декларируется даже невозможность) определения в биожидкостях спортсменов в процедурах допингового контроля. Эти соединения включены в группу 82 «Запрещенного списка» Ъ'АРА и являются, так называемыми, непороговыми субстанциями. Это значит, что пределы обнаружения их биомаркеров в допинг-пробах будут определяться возможностями аналитических методик. Необходимо также учитывать быструю деградацию коротких пептидов в организме, что даже при сверхнизких пределах обнаружения сокращает сроки их возможного детектирования после приема.

Все эти трудности приводят к тому, что при очевидной популярности ОНКР среди спортсменов известны лишь отдельные случаи установленных фактов их немедицинского применения, причем большинство из них связано с идентификацией ОНКР в изьятых субстанциях (т,н. «вещественных доказательствах»). Для обнаружения заранее неизвестных представителей группы ОНКР в процедурах допингового контроля необходимо знать, в какой биожидкости (моче или плазме крови), в каком виде (исходное вещество или метаболиты и если метаболиты, то какие), в рамках какого временного окна и на каком минимальном уровне концентраций могут быть определены искомые вещества. На все эти вопросы в работе И.О.Зверевой даны убедительные и развернутые ответы.

Важно отметить, что исследование метаболизма и кинетики выведения ОНКР актуально не только для допингового контроля, но и для возможного будущего медицинского применения препаратов на их основе для терапии ряда заболеваний и послеоперационного восстановительного периода в трансплантологии. Настоящая работа не только выполнена на актуальную тему, но и посвящена решению сверхсложной для аналитической химии задачи: определению следовых концентраций широкой группы нестойких соединений с неизвестным метаболизмом в биологических матрицах. В рамках одной науки — аналитической химии, эта задача не имела бы решения. Исследование метаболизма и кинетики выведения ОНКР выполнены в рамках другой научной специальности — биорганической химии.

При этом аналитический и биоорганический аспекты работы находятся в неразрывной связи. Таким образом, выполнение исследования в рамках двух научных специальностей — аналитическая химия и биоорганическая химия, является абсолютно оправданным: работа соответствует каждой из этих специальностей, а их объединение обусловило синергетический эффект и в итоге - успешное достижение цели. Из сформулированных автором шести задач, необходимых для достижения цели работы, половина (изучение метаболизма ОНКР /и И/го и т ито и выбор оптимальной модели /л Ийо) относится к области биоорганической химии, другая половина (выбор целевых метаболитов, разработка, валидация и апробация ВЭЖХ-МС/МС методики) — к области аналитической химии.

Обе панели задач разрабатываются параллельно, поскольку для обнаружения и идентификации метаболитов необходимо применение аналитической методики, а для формирования списка определяемых аналитов (биомаркеров ОНКР) требуются сведения о структуре метаболитов. В аналитических работах, посвященных исследованию метаболизма контролируемых субстанций, экспериментальная модель обычно выбирается случайным образом.

Модели /и и/го предпочтительны с этических и экономических позиций. Однако, полученные при их использовании результаты могут не подтвердиться в условиях /л ию. В качестве примера приведем историю с идентификацией метаболитов туринабола.

В этой связи системный подход к исследованию метаболизма наиболее распространенных представителей ОНКР следует отметить в качестве несомненного достоинства работы И.О.Зверевой. Результатом системного подхода является обоснованный и не вызывающий сомнений выбор целевых метаболитов для определения в рамках разработанной методики. Не менее важным результатом является сравнительная оценка приемлемости различных иг и~го моделей и рекомендация о предпочтительности применения человеческих почечной микросомальной и печеночной Б9 фракций для исследования метаболизма новых пептидных гормонов и рилизинг-факторов, появление которых неизбежно в будущем. Эти результаты в совокупности с оптимизированной в рамках четырех протоколов валидиро ванн ой процедурой определения важнейших ОНКР и их метаболитов в биожидкостях человека составляют весомый багаж теоретической и практической значимости работы, по объему и качеству не уступающий некоторым докторским диссертациям.

Значительная часть результатов работы характеризуется безусловной научной новизной. В частности, получены новые научные данные о метаболизме ОНКР-1, ОНКР- 2, ОНКР-З, ОНКР-б, гексарелина, ипаморелина. Установлены магистральные направления биотрансформации коротких пептидов группы ОНКР, заключающиеся в гидролизе пептидных связей и (или) дезамидировании в концевом аминокислотном остатке. Оценены временные окна детектирования в моче и плазме крови при требуемом пределе обнаружения (не хуже 2 нг/мл) биомаркеров пяти важнейших представителей группы ОНКР при внутривенном и интраназальном применении.

Установлена невозможность обнаружения в моче нативного ОНКР-1, при этом впервые идентифицирован его наиболее долгоживущий метаболит, обнаружение которого в моче уверенно проводится даже после интраназаль ного приема препарата. Попутно отметим, что, согласно современным представлениям, многие короткие пептиды при интраназальном применении почти мгновенно поступают в мозг и лишь в незначительной мере обнаруживаются в системном кровотоке и выводятся с мочой. Это значительно затрудняет их обнаружение при допинговом контроле и, соответственно, повышает ценность достигнутых автором аналитических результатов.

Достоверность и обоснованность результатов работы обусловлены продуманным планом экспериментов, использованием современных сертифицированных приборных комплексов и расходных материалов. Автор хорошо владеет теорией и практикой хроматомасс-спектрометрического анализа. Результаты работы представлены на б-ти конференциях, в том числе международных. Работа поддержана 4-мя публикациями в изданиях, рекомендованных ВАК и профильных для аналитической и биоорганической химии. Очень удачным представляется Заключение (стр. 125-127 диссертации), в котором четко и последовательно изложены основные результаты работы.

Автореферат в полной мере отражает содержание работы. Разночтений между диссертацией и авторефератом не выявлено. Замечания оппонента относятся не к сути диссертационной работы, а к некоторым моментам, касающимся представления результатов. В выводах №№ 1 и 3 (Автореферат, стр.22; диссертация — стр.128), таблице 10 диссертации (таблица 2 авто реферата) сообщается об идентификации большого количества метаболитов ОНДЕР. В аналитической химии термину «идентификация» соответствует точное установление структуры при соблюдении конкретного набора критериев. В данном случае следовало бы, как нам кажется, говорить скорее о том, что установлены, либо выявлены биомаркеры или метаболиты ОНДЕР.

Это не противоречит возможности установления факта приема контролируемого препарата на основании обнаружения в биопробе его метаболита, разумеется, в том случае, если доказана безусловная связь метаболита и исходного вещества, что в данной работе имеется. Таким образом, замечание относится лишь к употреблению термина «идентификация». Также отметим, что в заголовках таблиц 8, 9, 11 диссертации и таблицы 3 автореферата термин «элементиый состав» применен неправомерно. Цель работы (стр.7 диссертации, стр.4 автореферата) достигается с применением метода «сверхвысокопроизводительиой высокоэффективной жидкостной хроматографии». Ежегодно достигаются новые успехи в повышении производительности ВЭЖХ анализа. Через несколько лет работа Ирины Олеговны не утратит актуальности, но использованный режим ВЭЖХ уже не будет расцениваться как «сверхвысокопроизводительный».

С точки зрения оппонента, приставок «сверх- и супер-» лучше избегать в научной литературе, оставив их для рекламных сообщений. В тексте диссертации допущены отдельные незначительные неточности, опечатки. В частности, в таблице 4 диссертации (стр.51) при цитировании литературного источника для ипаморелина неверно указано значение тп/х продукт-иона. Методику для определения ОНКР и их метаболитов в моче (вывод № 7 в диссертации, стр. 129 и автореферате, стр.

22) в итоговой версии и в компактном виде было бы полезно привести в приложении к диссертации. Это повысило бы практическую ценность диссертационной работы для аналитиков, причастных к данной области исследований. Также, было бы интересно привести масс-хроматограммы, иллюстрирующие определение метаболитов ОНВР не только в пробах волонтеров, когда нх присутствие ожидалось, но и в реальном сценарии их обнаружения в скрининге и подтверждающем анализе. Это сделало бы более содержательным вывод №9 (стр.129 диссертации 23 автореферата). Перечисленные замечания являются незначительными и не снижают общего положительного впечатления от работы.

По актуальности, объему проведенных исследований, научной новизне и практической значимости, обоснованности выводов и положений, достоверности научных данных, - диссертация отвечает критериям и, 9 Положения «О порядке присуждения ученых степеней» ВАК Минобрнауки РФ (утвержденного Постановлением правительства РФ от 24.09.2013 г. № 842 в редакции от 21,04.2016 г. № 335), а ее автор, Зверева Ирина Олеговна, заслуживает присуждения ученой степени кандидата химических наук по специальностям 02.00.10 — «Биоорганическая химия» и 02,00.02 — «Аналитическая химии», доктор химических наук по специальности 20.02.23 «Поражающее действие специальных видов оружия, средства и способы защиты», кандидат химических наук по специальности 02,00.02 «Аналитическая химия» Савельева Елена Игоревна ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агентства России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г,п.

Кузьмоловский, ст, Капитолово, кори. № 93.тел. 8('812) 449-61-77 доб, 240 е-пза11: за~с11ега'ил11орЬе.ги Подпись заведующей лабораторией аналитической токсикологии ФГУП НИИ гигиены, профпатологии н экологии человека («НИИ Г~ЭЧ»), доктора химических наук Савельевой Елены Игоревны удостоверяю: Ученый щМ~~арь ФГУП «НИИГПЭЧ», доктор медицинских наук, профессор с Ф ':"'. «аз~ко В~в» ~рйаг 01,69.201 7 .