Отзыв ведущей организации (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля)

ОЪ' ВО «КубГУ» М.Б. Астапов 2017 г. отзыв ведущей организации на диссертационную работу Зверевой Ирины Олеговны кПрогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальностям 02.00.!Π— Бноорганическая химия и 02.00.02 — Аналитическая химия Актуальность исследовании. Последние тенденции развития физкультуры и спорта высших достижений на широкое применение молодежью и профессиональными спортсменами различных типов рилизинг-пептидов гормона роста и„в условиях непрекращающихся международных допинговых скандалов, тема диссертационной работы И.О.

Зверевой, посвященной разработке эффективных методов определения различных допинговых субстанций и оценке их применимости в допинг-контроле, является крайне актуальной. Несмотря на увеличение количества тестируемых проб и ужесточение наказаний в слу чае выявления нарушений антидопинговых правил, спектр потенциальных биологически активных препаратов, которые могут использоваться спортсменами для получения спортивных преимуществ и ускоренной реабилитации. с каждым ~одом растет, и Всемирное антидопннговое агентство (ВАДА) системно расширяет запрещенный список ежегодно. Многие из препаратов с потенциальным допинговым эффектом в настоящее время только проходят доклинические и/или клинические исследования, а, в некоторых случаях, даже не разрешены к приему. Это значительно ограничивает возможности для изучения метаболизма вл к!то в организме человека таких субстанций, поэтому важным является вопрос получения метаболитов различных соединений пептидной природы с использованием модельных систем 1и зчтго.

Научная новизна. Соискателем предложена и показана эффективность микросомальной почечной и $9 печеночной фракций человека в качестве модельных систем вэзгйго для прогнозирования метаболитов ОНКР, выявлены закономерности оиотрансформации !и лю 5 наиболее широко известных препаратов 6НКР в человеческом организме (для 4 из 5 препаратов — впервые). Разработана хромато-массспектрометрическая методика определения метаболитов 6НКР для выявления и предотвращения использования данного вида допинга в спорте. Особо следует отметить, что соискателем впервые дегектирован самый долгоживуший из описанных ранее метаболитов ОНКР-1 (2-4) ОН, мониторинг которого позволяет выявлять случаи злоупотребления 6НКР-1„который не обнаруживается в моче в исходном виде.

Проведена оценка влияния физиологических особенностей человеческого организма и способов приема на метаболизм 6НКР (на примере приема препаратов 6НКР-2 и 6НКР- 6), показана эффективность включения метаболитов в антидопинговую методику. Практическая значимость исследований. Разработана хромато-массспектромстрическая методика определения метаболитов С!НКР, которая позволила увеличить временное окно детектирования после приема допинга н достоверность идентификации.

В представленной диссертации разрабо~ана и внедрена методика определения 6НКР и их метаболитов в моче человека методом СВЭЖХ-МСУ!МС, в основу которой легли данные по метаболизму 6НКР, полученные с использованием различных моделей 1и я!!го и !и к!»о. Особо значимым успехом можно считать успешную валидацию предложенных методик в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и внесение их в область аккредишции Федерального государственного бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» (ФГБУ АДЦ).

Как следует из материала диссертационного исследования, опыт успешного применения предложенной методики определения 6НКР и их метаболитов уже позволил специалистам ФГБУ АДЦ выявить случаи злоупотребления соединениями данного класса спортсменами. Содержание работы. Диссертационная рабов И.О.

Зверевой изложена на 161 страницах, включая введение. литературный обзор. экспериментальную часть. результаты и их оосуждение. выводы. заключение, список литературы и приложение. В качестве иллюстраций диссертация включает 24 рисунка, 16 таблиц и список цитируемой литературы из 180 наименований. Во введении соискателем представлено обоснование выбора темы исследования и ее актуальности, сформулированы цели и задачи работы, научная значимость, теоретическая и практическая значимость работы, определены положения, выносимые на защиту. а также указывается количество публикаций по результатам исследований. Обзор литературы отличается полнотой и разнообразием рассматриваемой проблематики. В первой части обзора литературы повествуется о предпосылках появления группы соединений СНКР как стимуляторов выработки гормона роста при болезнях его дефицита, описан механизм их действия (основной и минорный сигнальные пути).

Вторая часть литературного обзора посвящена различным подходам увеличения периода полураспада соединений пептидной природы и особенности их метаболизма, И.О. Зверевой рассмотрены три основных подхода: замена аминокислотного остатка. замена пептидной связи и изменение Н- и С-концевых частей молекулы. В третьей части на основании краткого обзора об основных биологических моделях изучения метаболизма и аналитических подходах иденгификации метаболитов автором делается заключение о выборе метода и преимуществе хромато-масс-спектрометрических методов для идентификации образующихся метаоолитов ОНЕР. В заключительной части И.О. Зверевой значительное внимание уделено современным методам определения ОНДЕР и их метаболитов в допинг-контроле.

Нроведенный анализ литературных данных позволил И.О. Зверевой обосновать актуальность исследования. В экспериментальной части соискателем приведены используемые в процессе исследования химические реактивы и материалы, основное и вспомогательное оборудование. подробно изложены методики экспериментов. Использование комплекса современных высокоточных приборов и сертифицированных референсных образцов позволило автору получить достоверные результаты. Раздел «Результаты и обсуждсииии включает 3 подраздела. На первом этапе работы диссертантом И.О. Зверевой проведены исследования по изучению метаболизма восьми наиболее известных ОНДЕР с использованием различных моделей пл 1чуго и пяти наиболее популярных из них ОНВ.Р гп лпо после назального приема волонтерами. Среди выбранных автором моделей ья ппо использовалисги микросомальная фракция печени и почек человека, Я9 фракция печени человека.

сыворотка крови человека и протеолитическне ферменты, Обоснование выбора субклегочных фракций и протеолитических ферментов в достаточной мере приведено И.О. Зверевой в тексте диссертации. На основании полученных результатов диссертантом сделан вывод об эффективности использования почечной микросомальной и печеночной В9 фракций человека для симулирования процессов биотрансформации ОНЕР в человеческом организме. Оценка эффективности выбранных моделей ~и инго производилась не только по числу и разнообразию полученных метаболитов, но и сравнением с результагами т иго. что немаловажно при разрагкп ке методик определения различных соединений по их метаболитам.

Следующим этапом работы бьщо разработка и валидация методики определения ОНДЕР и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС. В процессе разработки оптимизированы условия СВЗЖХ-МС/МС анализа. этап установления необходимого значения рН образцов мочи перед твердофазной экстракцией. осуществлен подбор сорбеита.

Все четыре методики пробоподготовки валидированы в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО~МЭК ! 7025 и ряда технических документов ВАДА. Прн валидации автором определены следующие метрологические характеристики: селективность~специфичность. предел обнаружения, линейность, прецизионность в условиях одного дня и между днями, а также оценка степени извлечения анализируемых соединений и влияния матрицы.

На заключительном этапе представленной работы И.О. Зверевой представлены результаты по апробации разработанной методики. При апробации произведена оценка временных окон детектирования пяти наиболее известных ОНДЕР и их метаболитов в моче после приема пептидов волонтерами мужского пола, показано влияние индивидуальных особенностей метаболизма волонтеров и способов приема на процессы биотрансформации соединений. Представленные результаты свидетельствуют об эффективности разработанной методики определения ОНДЕР и их метаболитов в образцах мочи человека.

Тем не менее, по проделанной работе имеется ряд вопросов н замечаний: !) В экспериментальной части диссертационно~о исследования концентрации ОНДЕР-2 с метаболитом и ОНКР-6 определяются не только в образцах мочи волонтеров, но в сыворотке крови. Но из представленного материала не ясно, была ли разработана и валидирована методика определения ОНКР и их метаболитов в образцах сыворотки крови методом СВЭЖХ-МС/МС? 2) Судя из представленных результатов, количественный анализ испытуемых образцов проводился с использованием СВЭЖХ-МС!МС. С другой стороны в распоряжении Зверевой И.О. имелся и масс-спектрометр высокого разрец1ения. использовавшийся для качественного анализа и идентификации метаболитов.

Почему не рассматривалась возможность проведения количественного анализа с использованием МСВР. который мог бы быть оолее информативным". 3) Из текста диссертации не ясно, исследовалось ли влияние употребления пептидов на другие биохимические показатели организма человека, в частности. на гормональный фон'? 4) Из текста диссертации также не ясно, изучалось ли влияние состава подвижной фазы на эффективность ионизацни и параметры удерживания2 5) В тексте отмечены несколько незначительных опечаток. не совсем удачное использование условных обозначений (Р— метаболит вазопрессина на стр.