Автореферат (Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислород)

На правах рукописиЮДИНА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНАБИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕВОЙ КУЛЬТУРЫИ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГОПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукМосква - 2017Работа выполнена на кафедре химии естественнонаучного института Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Тульский государственный университет».Научный руководитель:кандидат химических наук, доцент,заведующий кафедрой химии, директорестественнонаучного институтаФедерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшегообразования «Тульский государственныйуниверситет»Алферов Валерий АнатольевичОфициальные оппоненты:доктор химических наук, профессор,профессор кафедры химии Федеральногогосударственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования «Липецкийгосударственный технический университет»доктор биологических наук, профессор,зам.

директора по научной работе, заведующийлабораторией биотехнологии и физиологиифототрофных организмов Федеральногогосударственного учреждения науки «Институтфундаментальных проблем биологии РАН»Ермолаева Татьяна НиколаевнаЦыганков Анатолий АнатольевичВедущая организация:Федеральное государственное бюджетное образовательноеобразования «Вятский государственный университет»учреждениевысшегоЗащита диссертации состоится 24 апреля 2017 года в 15 ч 00 мин на заседанииДиссертационного Совета Д 212.131.06 на базе Федерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшего образования «Московский технологическийуниверситет» по адресу 119571, Москва, проспект Вернадского, д.86, ауд. М-119.С авторефератом диссертации можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФhttp://vak.ed.gov.ru и https://mirea.ru.С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Московский технологический университет» по адресу: 119554, Москва, проспектВернадского, д.78 и на интернет сайте https://mirea.ru.Автореферат разослан «2017 г.»Ученый секретарь Диссертационного Совета,кандидат химических наук,старший научный сотрудникА.И.

Лютик21. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работыВ настоящее время актуальной является разработка методов иаппаратуры для экспресс-анализа природных и сточных вод. Одним изпараметров, определяющим интегральную загрязненность воды, являетсябиохимическое потребление кислорода (БПК). Стандартная методикаопределения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы втечение 5 или 20 суток (БПК5 или БПК20). В соответствии с мировойпрактикой эффективным подходом для экспресс-оценки БПК являетсяразработка биосенсоров на основе микроорганизмов, окисляющих широкийкруг органических веществ (Jouanneau, 2014), за рубежом создан рядкоммерческих БПК-биосенсоров на основе биореакторов.Для создания биочувствительных элементов БПК-сенсоров используютлибоассоциациимикроорганизмов(активныйил,искусственныеконсорциумы), способные окислять широкий спектр органических соединений,однако БПК-биосенсоры наих основе недостаточно стабильны из-заизменения состава консорциума (Арляпов, 2011); либо индивидуальныекультуры микроорганизмов с определенными потребительскими свойствами(стабильность при работе, способность окислять различные классыорганических веществ, устойчивость при иммобилизации и к воздействиюнегативных факторов окружающей среды) (Abrevaya, 2014).Ключевым моментом в формировании стабильного биочувствительногоэлементаБПК-биосенсора является иммобилизация микроорганизмов.Эффективные методы получения иммобилизованных клеток связаны спроцессами включения их в природные и синтетические гидрогели,протекающими, как правило, в мягких условиях и обеспечивающими высокийуровень диффузии субстратов и продуктов, а также невозможность для клетокпокинуть матрицу.

В качестве синтетического гелеобразователячастоиспользуют поливиниловый спирт (ПВС), однако его применение в качествеосновы рецепторного элемента биосенсорного анализатора затруднено, так какон образует тонкие, растворимые в воде пленки с низкой механическойпрочностью. Одним из подходов для создания сетчатых структурполивинилового спирта является введение сшивающих агентов. Получениемеханическипрочныхпленокгидрогелясиммобилизованнымимикроорганизмами обеспечит технологическую возможность тиражированиярасходных биочувствительных элементов для модификации кислородных3электродов оксиметров амперометрического типа.

Таким образом, для созданиябиосенсора для экспресс-определения БПК в первую очередь необходимопроизвести выбор эффективного биокатализатора и способ его иммобилизации.Цель работыРазработка биотехнологических основ создания амперометрическогобиосенсора для экспресс-определения биохимического потребления кислородана основе индивидуальной культуры и ассоциаций микроорганизмов.Задачи исследования1.Выбратьбиологическийматериал,составляющийосновубиочувствительного элемента БПК-биосенсора, по способности дрожжей родовOgataea, Candida, Debaryomyces, Arxula окислять широкий спектр органическихсубстратов, по устойчивости при иммобилизации на кислородном электроде истабильности при работе.2.Разработать полимерную матрицу на основе поливинилового спирта,модифицированного N-винилпирролидоном для создания нерастворимогосетчатого материала, подходящего для иммобилизации микроорганизмов, чтообеспечит технологические возможности тиражирования расходныхбиочувствительных элементов.3.Составить устойчивые во времени искусственные ассоциациимикроорганизмов, создать на их основе рецепторные элементы и определитьхарактеристики БПК-биосенсоров.

Сравнить основные характеристикибиосенсоров на основе индивидуальной культуры, искусственных иестественных (активный ил) ассоциаций микроорганизмов, иммобилизованныхвгидрогельполивиниловогоспиртамодифицированногоNвинилпирролидоном.4.Изучить влияние особенностей состава исследуемых проб (рH, соленостьи присутствие соединений тяжелых металлов)и условий анализа(температуры) на окислительную способность дрожжей, иммобилизованных вмодифицированный ПВС.5.Разработать методику определения БПК с использованием биосенсорногоанализатора.6.Провести апробацию БПК-биосенсоровна образцах природных источных вод и сравнить результаты со стандартным методом. На основеполученных результатов совместно с ООО «Эконикс-Эксперт» разработатьэкспериментальный образец биосенсорного анализатора БПК.4Научная новизна работыПоказано, что иммобилизация микроорганизмов, происходящаянепосредственновпроцессеформированиясетчатойструктурыполивинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, позволяетполучать биочувствительные гидрогели для использования в биотехнологии.Методом ЯМР-спектроскопии установлена структура поливинилового спиртасшитого при участии N-винилпирролидона.Впервые проведено сравнение основных характеристик микробныхамперометрических биосенсоров на основе индивидуальной культуры,искусственных и естественных (активный ил) ассоциаций микроорганизмов,иммобилизованных в гидрогель поливинилового спирта, модифицированногоN-винилпирролидоном.Впервые установлено, что дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482способны к окислению широкого спектра органических веществвсильносоленых средах и при наличии ионов тяжелых металлов вконцентрациях, превышающих ПДК, что позволяет использовать их длясоздания биочувствительных элементов биосенсоров.Практическая значимость работыИммобилизация целых клеток микроорганизмов в гидрогельполивинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, позволяетполучать стабильные биокатализаторы, которые можно использовать длясерийного изготовления биораспознающих элементов сенсоров.Сформированы биосенсоры кюветного типа для определениябиохимического потребления кислорода на основе индивидуальной культуры иассоциациймикроорганизмов,характеризующиесявысокойчувствительностью и экспрессностью, превосходящие мировые аналоги поданным характеристикам.

Работа вносит практический вклад в разработкубыстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяет в перспективепроизводить недорогие и эффективные анализаторы воды.Совместно с малым инновационным предприятием ООО «Эконикс–Эксперт» изготовленэкспериментальный образец амперометрическогобиосенсорного анализатора для экспресс-определения БПК, в результате чегоразработка подготовлена к промышленному выпуску.Разработана и аттестована в Госстандарте методика определения БПК сиспользованием биосенсорного анализатора.5По результатам работы получено 2 патента: патент на полезную модель№ 117918 от 28.10.2011 «Устройство для определения степени загрязненияводы биоразлагаемыми органическими веществами», патент на полезнуюмодель № 164144 от 21.10.2015 «Устройство для экспресс-анализа индексабиохимического потребления кислорода».Основные положения, выносимые на защиту1.Результаты формирования биочувствительных элементов биосенсоров наоснове микроорганизмов, иммобилизованных в гидрогель поливиниловогоспирта, модифицированного N-винилпирролидоном.2.Результаты создания эффективного биокатализатора для оценки индексаБПК на основе дрожжей Debaryomyces hansenii, окисляющих широкий спектрорганических соединений и устойчивых к высокому содержанию NaCl и ионовтяжелых металлов, что позволяет определять БПК в широком диапазоне вобразцах воды различного происхождения, в том числе и технологическихсточных водах с повышенным содержанием ионов тяжелых металлов.3.Результаты составления ассоциаций микроорганизмов, устойчивых втечение длительного времени, на основании различий субстратнойспецифичности и сходства удельных скоростей роста.4.Методика определения БПК с использованием биосенсорногоанализатора с иммобилизованными микроорганизмами.Апробация работыРезультаты работы докладывались на Московском международномконгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011,2013, 2015 гг.) (медали конкурса); Всероссийской конференции с элементаминаучной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2011 (дипломпобедителя конкурса), 2012, 2013, 2014 (диплом победителя конкурса), 2016; IXВсероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды«Экоаналитика-2014» (Светлогорск, 22 – 28 июня 2014 г.