Диссертация (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ), страница 3

Экспериментальные методики приведены в экспериментальнойчасти, а также в оригинальных публикациях автора, в которых изложеносодержание данной диссертации (см. список публикаций автора по темедиссертации).11ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХГлава 1. Структурные основы катализа под действием LOXЛипоксигеназы (LOX) – ферменты перекисного окисления липидов – являютсядиоксигеназами, содержащими негемовое железо [1, 32, 33]. Они катализируютстереоспецифическоепероксидированиеполиненасыщенныхжирныхкислот(ПНЖК), содержащих, по крайней мере, одно 1Z,4Z-пентадиеновое звено. Процессокисления жирных кислот при участии LOX обычно включает четыре стадии:отщепление водорода, радикальную перегруппировку, введение кислорода ивосстановлениеперокси-радикала,протекающиесострогоконтролируемойстереохимией (Схема 1).

Отщепление водорода является лимитирующей стадией[34], контролируемой законами квантовой механики [35]. Перенос водородасопровождаетсяпереносомэлектронаипротона,приэтомэлектроннелокализуется на протоне, а переносится непосредственно от субстрата к Fe3+ [36,37]. В переходном состоянии соединенный ковалентной связью мостик Fe–(OH)–Cпонижает энергетический барьер реакции и обеспечивает наиболее эффективныйпуть для ее протекания [36]. Хотя некоторые из изоформ LOX и способны окислятьПНЖК в составе липидов, расположенных в биомембранах и липопротеинах [38–40], для большинства LOX cубстратами являются исключительно свободныеПНЖК, что предусматривает необходимость их высвобождения из состава липидовпри помощи ферментов, гидролизующих сложные эфиры, преимущественно поддействием фосфолипазы А2 [41]. Общепринятая номенклатура классифицируетLOX млекопитающих по их позиционной специфичности (положению введениякислорода в молекулу АК) как 5-LOX, 8-LOX, 11-LOX, 12-LOX или 15-LOX, а такженаосновеконфигурацииасимметрическогогидроксильногоцентравобразовавшемся продукте как S- или R-LOX.

Подобная классификация неидеальна по ряду причин: АК не является оптимальным субстратом длябольшинства LOX не млекопитающих; ПНЖК состава С18 с меньшей степеньюненасыщенности,субстратамиэтихтакиекакЛКферментов,и линоленоваякислоты,покотношениютакжекоторымявляютсяреакционнаяспецифичность LOX может сильно различаться. В отличие от LOX с низкойстепенью филогенетического родства, даже эволюционно-родственные изоформыLOX могут проявлять различные ферментативные свойства. Возрастающее числообнаруженных геномных последовательностей, кодирующих LOX, а также попыткипредсказатьспецификуокисления12АКСхема 1.Механизм окисления ПНЖК, катализируемого LOX: 1) стереоселективноеотщепление водорода сопровождается восстановлением каталитически активной Fe 3+–ОН-формы фермента в каталитически неактивную Fe2+–LOX; 2) радикальнаяперегруппировка, при которой электрон жирнокислотного радикала смещается либо в[+2], либо [-2] положение по отношению к карбоксильной группе субстрата; 3)антароповерхностное присоединение кислорода; 4) восстановление перокси-радикалапосредством переноса электрона от Fe2+–LOX с образованием окисленной формыфермента.исключительно на основе первичной структуры белка приводит к запутаннойситуации,вследствиечегобольшинствоизоформLOXнемогутбытьклассифицированы в соответствии с номенклатурой, основанной на позиционнойспецифичности фермента.

Напротив, классификация, в основе которой лежитфилогенетическая связь различных групп LOX, является наиболее подходящей. Ксожалению, до настоящего времени не было предложено ни одной простой иобъединяющей номенклатуры LOX, которая бы учитывала вышеупомянутыепроблемы.Другойпроблемой,котораявыделяетисследованияLOXвмолекулярной энзимологии, является наличие нескольких изоформ в пределаходного вида, а также функциональная гетерогенность этих изоферментов. Так, всое было идентифицировано 13 различных изоформ LOX; геном риса содержитболеечем20геновразличныхLOX.Человеческийгеномвключает6функциональных генов LOX, тогда как геном мыши – 7 (по сравнению спсевдогеном кластера LOX человеческого гена ген 12S-LOX эпидермиса мыши неявляется функциональным).131.1.

Липоксигеназы млекопитающих представляют собой единуюполипептиднуюцепь,котораяорганизованаввидедвухдоменнойструктуры; в низших организмах встречаются гибридные белки. Наосновании анализа структур ряда LOX растительного и животного происхождения иих комплексов с лигандом в кристалле (табл. 1) можно заключить, что большинствоизоформ LOX состоят из одной полипептидной цепи, которая организована в видедвухдоменной структуры: малого N-терминального -складчатого домена ибольшого -спирального каталитического домена (рис. 1).

12/15-LOX кролика(r12/15-LOX) имеет форму цилиндра высотой 10 нм с эллиптическим основанием(большой радиус 3,05 нм, малый радиус 2,25 нм). 8R-LOX кораллов, которая посвоей структуре довольно близка к ферменту кролика, напоминает цилиндр срадиусом основания 3 нм и высотой 10 нм [59], тогда как 11R-LOX кораллов [64],несмотря на общее структурное сходство, отличается в организации внешних спиралей каталитического домена. В то же время растительная LOX1 сои имеетформу эллипсоида (9×6,5×6 нм) [48].В низших организмах LOX встречаются в виде гибридных белков, в которыхлипоксигеназный домен связан с другим каталитическим доменом, играющим рольво вторичном метаболизме гидропероксидов жирных кислот.

Первый гибридныйбелок LOX был обнаружен в кораллах Plexaura homomalla [66]. В нем LOX-доменсвязан с гемсодержащим доменом пероксидазы, превращающей пероксидыжирных кислот в алленоксиды с последующим образованием эйкозаноидовциклопентенонового ряда. Гибрид этого белка был клонирован и обе единицыгибрида были выделены и охарактеризованы индивидуально [67, 68]. Также былиидентифицированы их кристаллические структуры [59, 60, 69].

Хотя степеньсохраненияаминокислотнойпоследовательности(АКП)LOX-доменаэтогогибридного белка по отношению к АКП r12/15-LOX была достаточно низка (30%),трехмерные структуры двух изоформ LOX довольно схожи друг с другом. Структуранизкого разрешения гибридного белка указывала на то, что домен алленоксидсинтазы нековалентно связан с субдоменом LOX, в то время как предполагаемыесайты связывания ионов кальция и остатки Trp, участвующие во взаимодействии слипидными мембранами, экспонированы на поверхности фермента [58].

При этоммембранноесвязываниегибридногобелкаприводилокизменениямпространственной ориентации субдоменов по отношению друг к другу и, какследствие, появлению нового сайта протеолитического расщепления [58]. Другой14Таблица 1. Структурные данные LOX, опубликованные в банке данных белкови нуклеиновых кислот (PDB)LOXЛиганд / комментарииРазрешение,ǺPDBкодМутантные формыLOX1 соиLOX1 соевых бобовЛит.источник[42–44]лиганд отсутствует2,602SBL[45]лиганд отсутствует1,401YGE[46]уточнение 1YGE1,401F8N[43]лиганд отсутствует2,601LNH[47]при температуре окружающейсреды2,01RRH[48]при 93 К2,01RRL[48]VLX-B соевых бобов2,402IUJ[49]VLX-D соевых бобов2,402IUK[49]2,201HU9[50]лиганд: 13(S)-HрODE2,01IK3[51]лиганд: протокатехуровая2,101N8Q[52]лиганд: эпиголокатехин2,101JNQ[53]лиганд: 4-нитрокатехол2,151NO3[54](1BYT)[55]LOX3 соевых бобовLOX3 соевых бобовлиганд: 4-гидроперокси-2метоксифенолкислотаr12/15-LOX кроликалиганд: ингибитор RS72,401LOX[31]повторный анализ структуры1LOX, димер с ингибиторомRS72,402P0M[56]3,6,9,12-тетраоксаэйкозанол-12,634NRE[57]8R-LOX-fusion proteinPlexaura homomalla3,503DY5[58]8R-LOX кораллов3,202FNQ[59]1,853FG1[60]арахидоновая кислота,анаэробные условия2,04QWT[61]неполная структура2,603D3L[62]модифицированная структура2,403O8Y[63]2,703VF1[64]1,903RDE[65]15-LOX-2 человека12-LOX тромбоцитовчеловека5-LOX человека11R-LOXGersemia fruticosa12-LOX лейкоцитовсвиньикатал.

домен; лиганд:ингибитор:4-(2-оксапентадека-4ин)фенилпропионовая кислота15гибридный белок LOX, обладающий 84%-ой идентичностью последовательности сАКП LOX Plexaura homomalla, был обнаружен в коралле Gersemia fruticosa [70], чтопредполагает наличие этих ферментов в октокораллах. Кроме того, гибридыРис. 1. Изображение структур различных липоксигеназ. Изображения получены спомощью программы VMD и представлены в единой проекции методом наложенияструктур.алленоксид-синтазы и LOX были обнаружены в цианобактериях Anabaena PCC7120 и Acaryochlorismarina [71, 72]. В отличие от ферментов кораллов, в которыхгибриды содержат завершенные последовательности липоксигеназ, в изоформахцианобактерийотсутствуетN-терминальныйдомен.Приэтомусеченныйкаталитический домен LOX сохраняет свою каталитическую активность.

Хотябиологическая роль гибридных белков не ясна, они участвуют в биосинтезесигнальных молекул липидной природы [66, 73]. Во всех гибридных белках доменыLOX связаны с С-концевым остатком нелипоксигеназной единицы. Таким образом,С-терминальная аминокислота, которая представляет собой один из пятинепосредственных лигандов железа, остается свободной.

Этот факт имеет16функциональное значение, так как ранее проведенные исследования мутагенезапоказали, что усечение молекулы LOX по С-концу приводит к нарушениям свойствэтих ферментов.1.2.МалыйN-терминальныйдоменLOXявляетсяважнымструктурным элементом, отвечающим за мембранное связывание икаталитическую активность.

N-Терминальный (β-складчатый) домен всехLOX, для которых получены кристаллические структуры, в основном состоит изантипараллельныхβ-складокинапоминаетструктуруС2-доменалипазыподжелудочной железы [74]. У LOX1 сои β-складчатый домен содержит первые 146остатков АКП белка. В случае r12/15-LOX и 8R-LOX кораллов β-складчатые доменыобразованы первыми 110 и 114 аминокислотными остатками, соответственно.

N- иC-концевые домены ковалентно связаны неупорядоченным олигопептидом. Хотя βскладчатые домены изоформ LOX сои превышают по размеру таковые ферментовмлекопитающих, их общие структуры обладают высокой степенью схожести (рис.1). N-Терминальный домен r12/15-LOX кролика образует с С-концевым доменомповерхностный контакт общей площадью 1600 Å2 [31]. У LOX1 сои эта поверхностьсущественно больше по размерам (2600 Å2), что предполагает наличие болеесильного междоменного взаимодействия в случае растительной LOX.

Высокаястепень сохранения двухдоменной структуры липоксигеназ свидетельствует офункциональной роли N-терминального -складчатого домена. Ограниченныйпротеолиз LOX1 сои приводит к образованию усеченного варианта LOX, в которомотсутствует N-терминальная часть [75]. Эта «мини-LOX» каталитически активна,при этом обладает пониженным сродством к линолевой кислоте (КМ ~24,2 мкМ для«мини-LOX» против 11,2 мкМ для нативной LOX) и проявляет более высокуюактивность (Vmax 363 с-1 для «мини-LOX» против 55 с-1 для нативного фермента).Эти данные говорят о том, что общая каталитическая эффективность «мини-LOX»(kcat/KM)повышаетсяврезультатепротеолиза.Болеетого,усечениеN-терминальной части приводит к структурным изменениям в области субстратсвязывающей полости, так как в отличие от нативного фермента негемовое железо«мини-LOX» может быть обратимо удалено из активного центра [76].