Диссертация (Теоретическое и экспериментальное исследование теплообмена при многозондовом низкотемпературном воздействии на биоткани), страница 4

[93] скорость охлаждения является решающимфакторомвыживаемостизамороженныхклеток.Однозначнохарактеробразования твердой фазы в клетках биоткани зависит от того, образуютсязатравочные кристаллы или нет, а также от скорости изменения температурыпри понижении температуры (Рисунок 1.1).Рисунок 1.1. Характер процесса в клетках и межклеточном пространстве принизкотемпературном воздействии1 – медленное охлаждение; 2 – быстрое охлаждение; 3 – сверхбыстроеохлаждение; 4 – внеклеточные кристаллы льда; 5 – дегидратированная клетка;6 – аморфная структура (отсутствует кристаллическая решетка)Скорости охлаждения в численном виде классифицируются согласноТаблице 1 [18,19].

Каждый тип клеток обладает своей так называемой «кривойвыживаемости» (сигнатура выживаемости), в соответствии с которой наиболеевероятная выживаемость обеспечивается оптимальной скоростью охлаждения,с двух других сторон от этой скорости вероятность разрушения клетки21увеличена [1]. При оптимальной скорости замораживания должна происходитьумеренная дегидратация клеток, что препятствует образованию крупныхкристаллов внутри клетки (Рисунок 1.2).Таблица 1.Классификация скоростей охлаждения биотканей№Наименование скоростиЧисловой диапазон скоростиохлажденияохлаждения1Очень медленноедо 10 °С/час (до 0,166 °С/мин)2Медленноеот 10 °С/час до 10 °С/мин3Быстроеот 10 °С/мин до 60 °С/мин4Очень быстроеот 1 °С/сек до 100 °С/сек5СверхбыстроеБолее 100 °С/секРисунок 1.2. Кривая выживаемостиВ большинстве работ по определению кривой выживаемости для тогоили иного типа клеток использовались тесты сразу после замораживанияи оттаивания [94].

Был разработан атлас выживаемости клеток на картескоростей охлаждения для различных типов клеток [93]. Стоит подчеркнуть,что данные кривые выживаемости имеют приблизительный характер, так как22они получены при исследовании клеток и их суспензий, а не цельныхбиотканей, представляющих из себя более сложную многокомпонентнуюструктуру.Примедленнойскоростиохлажденияпроисходитвнеклеточная(межклеточная) кристаллизация. В зарубежной литературе данный процессносит название «Solution effect» [91,95,96]. В работах [97,98] этот эффектназывают одной из главных причин разрушения клетки от замораживания.Внеклеточная кристаллизация состоитиз несколькихэтапов.

Сначалакристаллы начинают расти. Так как межклеточные растворы содержат многорастворенных веществ с различными температурами окончания фазовогоперехода, следовательно, что при их замерзании компоненты системыохлаждаются в различное время и относительная концентрация растворенноговеществаповышаетсявместес общейконцентрациейраствора[18].Внутриклеточная жидкость покидает клетку через мембрану благодаряявлению осмоса. Осмос представляет из себя процесс односторонней диффузиичерез полунепроницаемую мембрану клетки молекул растворителя в сторонубольшей концентрации растворенного вещества из объема с меньшейконцентрациейрастворенноговещества.Создаетсягиперосмотическаяокружающая среда с дегидратацией клеток и последующим обезвоживанием игибелью клеток [99,100].

Также потеря воды является причиной сокращенияклеток, повреждения мембран и компонентов. Наступает момент, когдасокращение клетки достигает максимального значения, хотя внеклеточнаяконцентрация продолжает расти. И когда градиент концентрации становитсязначительным, растворы внеклеточной жидкости пропускаются в клетку, чтоприводит к действию механической силы на клетки, которая повреждает иразрушает их.

То есть при внеклеточной кристаллизации разрушение клеткипроисходит или из-за обезвоживания вследствие дегидратации клетки или из-задействия механической силы на клетку [95,100].Прибыстройскоростиохлажденияпроисходитвнутриклеточнаякристаллизация.

Внутриклеточная жидкость не может быстро покинуть клетку23для поддержания осмотического равновесия между внутри- и внеклеточнымирастворамиипереохлаждается,Эта неустойчивостьи внутриклеточнойприводитстановитсяккристаллизации.всеболееобразованиюнестабильной.зародышейВнутриклеточныельдакристаллыльданеобратимо разрывают мембрану клетки из-за расширения в объеме. В то жевремянарушаетсяправильноефункционированиеорганеллклеткии разрушаются раковые клетки [91,94,98]. Показано, что увеличение скоростиохлажденияна перифериицелевогоопухолевогоузлавпределахот2 до 15 °С/мин, а также снижение температуры в диапазоне от 268 до 228 К(от минус 5 до минус 45 °С) сопровождается достоверным усилениемдеструктивного эффекта от 2 до 3 раз [20].Скорость оттаивания влияет на вероятность выживаемости/гибели клетокпосле низкотемпературного воздействия.

При медленной (естественной)скорости оттаивания возрастает вероятность рекристаллизации внутри клетки,так как небольшие кристаллы льда в процессе отогрева агрегируютсяс образованием более крупных кристаллов, что в свою очередь приводитк повреждению содержимого клетки и повышению вероятности разрушенияклетки. При высокой скорости оттаивания вероятность выживания клеткивозрастает [1,101]. Оценено влияние скорости отогрева при криовоздействиина опухоли в условиях in vivo. Выявлено, что увеличение скорости отогревав 2 или 3 раза, по сравнению с естественным, приводит к уменьшениюповреждающего эффекта низкотемпературного воздействия [20].В зарубежной литературе фактор времени выдержки носит название «holdtime».

Это время работы криохирургической установки, когда температуранекроза в целевой области уже достигнута или ниже. Криобиологическиеисследования показали, что уничтожение клеток в той же степени может бытьдостигнуто при температуре минус 10 ºС при длительном времени выдержкии при температуре минус 20 ºС при коротком времени выдержки, при этомне уточняется клеток каких биотканей [102]. В большинстве медицинскихцентров время выдержки составляет 15 минут [84,103].24Smith D.J. и соавторы провели параметрическое исследование в планеполученияповрежденияот заморозки.опухолевыхПроизведеноклетоксовмещениепростатымеждукрысытепловойАТ-1историейи повреждениями клеток через 2-уровневый 4-параметрический эксперимент.Результаты показали, что наиболее существенными являются влияниеизмененияконечнойтемпературы,временивыдержкиинахожденияих оптимального сочетания [104].На повреждение биотканей при криовоздействии оказывают влияниемеханические напряжения, возникающие в объеме биоткани из-за разницыв удельных объемах жидкой и твердой фаз, а также термомеханическиенапряжения, которые возникают в объеме увеличивающейся зоны заморозкипод действием разницы температур и фазового перехода жидкости в твердуюфазу.

Такие напряжения могут приводить к деформации, сопровождающейсявспучиванием, взаимным смещением участков ткани, образованием трещин,что в конечном итоге приводит к повреждению и разрушению биологическойткани [2].К способам усиления криогенного воздействия на биообъекты относятсямногократные циклы замораживания-оттаивания, которые увеличивают зонузамораживания и некроза в среднем на значение от 15 до 20 % [1,105].На практикевбольшинствекриооперацийиспользуютдвойнойциклзамораживания с естественным оттаиванием. Lee и соавторы рекомендовалидвойной цикл замораживания-оттаивания с покрытием целевой областис температурой минус 20 ºС [106].

Использование тройного цикла заморозкибылопредложенодлябольшегоцитотоксическогоэффектавболееволокнистых опухолях и тканях [95,107]. Проводились исследования на легкомсвиньи in vivo. Было предложено внести изменение в схему обычноиспользуемого цикла 10-5-10-5 минут и применить тройной цикл – 3-3-7-7-5-5минут.

Исследователи обнаружили, что тройной цикл имеет преимуществаперед двойным в криодеструкции легкого, включая ранее полученныеизображения зоны деструкции, меньшее время процедуры и более крупный25объем зоны некроза [108]. Увеличение зоны гибели клеток происходит, каксчитает Whittaker D.K.

[109], по причине зависимости размеров кристалловльда от числа циклов заморозки. Дополнительно следует добавить, что зоназамораживания и некроза увеличиваются при втором и последующемохлаждении, так как начальная температура целевой области перед вторымзамораживаниемниженачальнойтемпературы,чемпередпервыми уменьшается влияние мелких кровеносных сосудов, которые попали в зонузамораживания при первом воздействии.К усилению низкотемпературного воздействия приводит введениев область разрушения раствора лидокаина, адреналина, дистиллированнойводы, что приводит к возрастанию зоны крионекроза на значение от15 до 20 % [2,110].

Увеличение жидкой фазы в целевой области воздействияведеткувеличениюинтенсивностизамораживаниябиотканинижекриоскопической температуры, так как коэффициент теплопроводности льдапримерно в 4 раза выше, чем у воды.Низкотемпературное воздействие в сочетании с предварительным СВЧили УЗ воздействием приводит к повышению эффективности метода.Сторонниеисследованияпоказали,чтообъемзонызамораживанияувеличивается от 60 до 100 % после комбинированного СВЧ и криовоздействияпо сравнению с обычным из-за более интенсивного вымерзания влаги [21,22].ПроводилисьисследованияподинамикельдообразованияприСВЧ-криовоздействии на образцах печени кролика методом ядерного магнитногорезонанса. Выявлено, что количество вымерзшей воды в данных образцахна значение от 10 до 15 % больше, чем в контрольных, подвергшихся тольконизкотемпературному воздействию [23].Существует предположение, чтоточкой приложения СВЧ-поля являются дипольные структуры, основную частькоторых представляет связанная вода [24]. Под действием СВЧ полярныемолекулы переходят в возбужденное состояние, возникают резонансныеявления.Могутменятьсязоныгидратации,возникатьразрывымежмолекулярных связей [25].

Все перечисленное дестабилизирует структуру26воды, приводит ее в более подвижное и чувствительное состояние к различнымвоздействиям.ТоестьСВЧ-полевоздействуетнаводнуюрешеткубиологических тканей, в результате чего возрастает содержание свободнойжидкости и повышается доля замороженной воды при низких температурах.Это ведет к увеличению коэффициента теплопроводности зоны воздействия.Проводились исследования, направленные на выявление оптимальных режимовСВЧ-воздействия для максимального крионекроза. За основу было взятоизучение коэффициента теплопроводности биоткани в зависимости от времении параметров СВЧ-излучения. Использовался прибор «Плот» с длиной волны33 см, диаметром облучателя 3 см и частотой колебаний 915 МГц. Объектомисследования была печень кроликов как in vitro, так и in vivo. Выявлено, чтодлямаксимальнойэффективностинизкотемпературноговоздействиядостаточно СВЧ-излучение с мощностью 10 Вт и временем 3 минуты in vitroи 3-5 минут in vivo.

Было показано, что наиболее оптимальное времякриовоздействия – сразу после СВЧ-излучения и первые 5 минут после него,далееидетрезкоеснижениекоэффициентатеплопроводности.Это подтвердилось в дальнейшем на эксперименте, который показал, что послеоблучения в течение первых 5 минут зона некроза значительно повышается посравнению с контрольной группой, тогда как через 30 минут после облученияне отмечается увеличение зоны некроза. Также было показано, чтоморфологическаякартинаСВЧ-крионекрозапринципиальноничемне отличается от картины обычного крионекроза.