11246 (Белки клеточного цикла в отделах мозга сусликов citellus undulatus на разных стадиях гибернационного цикла)

Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В. Г. Белинского

Факультет Естественно-географический

Кафедра биохимии

БЕЛКИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В ОТДЕЛАХ МОЗГА СУСЛИКОВ CITELLUS UNDULATUS НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ГИБЕРНАЦИОННОГО ЦИКЛА

Введение

Зимняя спячка представляет собой форму адаптации животных к действию неблагоприятных условий обитания: низкой температуры окружающей среды, отсутствию пищи и т.д. [6, 39, 4] Затрачивают все уровни организации от биохимического до поведенческого, и реализуются генетические программы, запускаемые при действии соответствующих внешних (укорочение фотопериода, понижение температуры, бескормица и т.д.) и внутренних факторов (цирканнуальные ритмы нейромедиаторов, пептидов и гормонов) [ 3, 32].

Состояние гибернации у зимоспящих животных характеризуется тем, что при переходе в это состояние температура тела понижается и часто достигает околонулевых значений. Наблюдается существенное снижение частоты сердечных сокращений – приблизительно с 250 до 8-10 ударов в 1 мин и снижение частоты дыхания – со 150 до одного или менее дыхательных циклов в 1 мин [ 5 ]. Отмечается снижение уровня метаболизма от 0,2 кал/(г·мин^-1) при гибернации [ 1 ]. Показано, что общее потребление энергии в сезон гибернации (включая периодические регулярные выходы из спячки) у гибернирующих животных на 87% меньше, чем у активных [ 39 ]. В течение гибернационного сезона наблюдаются периодические выходы животных из состояния спячки с соответствующим повышением уровня метаболизма и температуры тела [ 39 ]. Таким образом, гибернация делится на периоды спячки (бауты), которые прерываются короткими (обычно 24 ч или меньше) периодами эутермии.

Процессы погружения в спячку и пробуждения, а также длительность баутов контролируются центральной нервной системой. Даже во время глубокой зимней спячки некоторые отделы мозга сохраняют достаточно высокую активность. Так, в лимбической системе (а именно в септуме, гиппокампе, гипоталамусе) наблюдается почти постоянная ЭЭГ-активность на протяжении всего баута [ 10 ].

Проблема зимней спячки имеет не только общебиологический интерес, но и привлекает внимание с непосредственно практической точки зрения: полученные фундаментальные данные могут быть положены в основу разработки методов создания гипобиоза, управляемого при помощи естественных механизмов, что чрезвычайно важно для клиники, когда требуется поддержать организм более или менее длительное время в состоянии значительно сниженных физиологических функций. Такая регулируемая искусственная гипотермия, вызывающая лишь умеренно вредные эффекты, способствует повышению устойчивости организма к влиянию ряда неблагориятных факторов, прежде всего тканевой гипоксии, которая часто сопутствует различным видам патологических процессов, в частности нарушениям кровообращения [ 3 ]. Результаты исследования нейрогенеза у сусликов при смене функционального состояния мозга во время гибернационного цикла в литературе отсутствуют, однако наличие его показано у птиц при смене сезонов и наступлении весны. Ряд авторов рассматривает гибернацию как модель ишемии мозга, при которой снижение кровотока, доставки кислорода и глюкозы во время спячки, а также последующая реоксигенация при выходе из спячки не приводят к повреждению и гибели клеток. Однако для ряда ишемических состояний, связанных с нейродегенерацией и гибелью клеток мозга, показано увеличение интенсивности нейрогенеза в постишемический период.

В связи с этим, целью работы явилось исследование экспрессии белков клеточного цикла (циклинов – А, В1, циклинзависимых киназ- cdc2, cdk2, cdk4, МСМ2) и не связанной с клеточным циклом циклинзависимой киназы cdk5 в мозге сусликов Citellus undulatus на разных стадиях гибернационного цикла.

Задачи:

1. Определить экспрессию белков клеточного цикла:

• циклинов- ClnA, ClnB1;

• циклинзависимых киназ- cdc2, cdk2, cdk4;

• маркёра пролиферирующих клеток MCM2;

1. Определить экспрессию циклинзависимой киназы cdk5, не связанной с клеточным циклом.

2. Выявить различия в экспрессии белков клеточного цикла на разных стадиях гибернационного цикла и при разной температуре тела животных.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Биохимические изменения в тканях при зимней спячке

Зимняя спячка (гибернация) – это закрепленная в ходе эволюции уникальная способность к минимализации жизненных функций организма, позволяющая ряду видов млекопитающих в течение многих месяцев переживать холод, бескормицу, сокращения светлого периода суток [ 5 ]. В Европе, Азии, Америке впадают в зимнюю спячку почти все виды летучих мышей, ежи и многие грызуны: сони, тушканчики, хомяки, бурундуки, суслики и сурки [ 6, 39 ].

Основой этого приспособления, по-видимому, являются крайне разнообразные пути сохранения энергетического баланса организма при сезонных изменениях во внешней среде. Подсчитано, что в течение зимней спячки (7-8 мес.) сусликов экономится от 80-90% энергии, которая могла бы быть потрачена на поддержание обычного уровня метаболизма [ 34 ].

Зимняя спячка является прерывистым процессом и состоит из баутов. Баут спячки состоит из входа в гипобиоз, пребывания в торпидном состоянии и выхода из него [39]. Каждый баут спячки может продолжаться от нескольких часов до нескольких недель и зависит как от физиологических особенностей животных, так и условий окружающей среды [ 37 ].

Температура тела млекопитающих во время зимней спячки снижается вплоть до 0°С. Понижение температуры тела приводит не только к частичной или полной потере чувствительности и двигательной активности, но и подавлению активности всех функций и систем организма: кровообращения, дыхания, пищеварения, водно-солевого обмена, гормонального статуса, размножения [37, 39]. Характерным для спячки является резкое замедление дыхания, в то время как в активном состоянии животное делает от нескольких десятков до нескольких сот дыханий в минуту [6]. Выход из состояния оцепенения сопровождается резким усилением дыхания, быстрой реперфузией тканей, активацией липолиза [36]. Известно, что уровень потребления кислорода отражает уровень метаболизма. Так во время пробуждения за 2 часа температура тела повышается с 0°С до 37°С, а потребление кислорода увеличивается в 50 раз [ 27, 36 ].

У гибернирующих животных сильно (более чем на 50%) увеличивается масса тела [34]. Известно, что при гибернации жир млекопитающих становится основным энергетическим субстратом [12]. Обильные запасы жировой ткани обеспечивают животным существование в течение длительного времени [34].

Бауты гибернации длиннее и глубже в середине зимы. В периоды пробуждения животные разогреваются и просыпаются. Температура тела приходит в норму [34, 35].

Пробуждение млекопитающих происходит или вследствие согревания при повышении температуры среды, или при понижении ее ниже 0°С.

Скорость пробуждения различна, но обычно оно происходит очень быстро. Резко увеличивается частота дыхания и сердцебиения. Повышается интенсивность окислительных процессов в организме, почти полностью расходуется запас гликогена печени [6]. При пробуждении, в фазе повышенного термогенеза, частота сердцебиений достигает более 400 уд/мин [9 ]. Ведущая роль в регуляции зимней спячки и периодических пробуждений принадлежит нервной и эндокринной системам [1]. У гибернирующих животных наряду с биохимическими наблюдаются и некоторые морфологические изменения в ткани мозга. Так, древовидные структуры дендритов укорачиваются при понижении температуры тела и быстро растут при её повышении; при впадении в спячку сокращается площадь тела нейрона [18, 19 ].

1.2 Клеточный цикл

В норме клеточный цикл - это последовательность событий, приводящих к делению исходной клетки на две дочерние. Его подразделяют на четыре фазы (или стадии): S фаза (в ней происходит репликация ДНК) и М фаза (фаза митоза) разделены промежутками – это фазы G1 и G2. Покоящиеся клетки находятся в G0 фазе [30 ].

Для нервных клеток млекопитающих показано, что повторное вступление клетки в клеточный цикл зависит от внеклеточных сигналов. К ним относят митогенные стимулы (например, факторы роста FGF и EGF, тромбин, сыворотка) и факторы дифференцировки (цитокины, стрессорные влияния на клетку – такие как ультрафиолетовое излучение, или повреждающие ДНК воздействия) [ 31 ] . Эти сигналы осуществляют свое влияние через последовательную экспрессию, активацию и деактивацию так называемых белков клеточного цикла - комплексов циклинов (Cn) с циклин-зависимыми протеинкиназами (cdk). Cn/cdk комплексы обеспечивают развитие клеточного цикла, и тонко регулируются множеством механизмов: транскрипцией, фосфорилированием, протеолизом, а также активностью ингибиторов циклин-зависимых протеинкиназ (i-cdk). В ходе онтогенеза экспрессия и активное взаимодействие циклинов, Cn/cdk комплексов и i-cdk сопровождается выходом клетки из клеточного цикла, приводящим к дифференцировке. Во взрослом организме эти агенты участвуют в контроле клеточного цикла, а i-cdk останавливают пролиферацию нейронов, предотвращая появление опухолей.

Выход клетки из покоящегося состояния (фазы G0) и запуск фазы G1 обеспечивается так: митогенные стимулы активируют митоген-зависимые протеинкиназы (МАРК) и экспрессию циклина D (CnD) (рис. 1):

Сn D/Cdk4

Cn D/Cdk6

Cn A/Cdc2

Cn B/Cdc2

Cn A/Сdk2

Cn E/Сdk2

Рис. 1. Схема клеточного цикла.

Далее происходит образование комплекса CnD/cdk4 (или cdk6), который обеспечивает переход клетки из фазы G0 в фазу G1. Если в этот период экспрессия CnD подавляется (воздействием МАРК, активированных, например, в результате клеточного стресса), то происходит остановка клеточного цикла на стадии G1. В начале фазы G1 в клетке появляется CnE (деактивация которого также приводит к остановке клеточного цикла в G1 фазе). Для осуществления перехода в следующую фазу цикла – S фазу, необходимо образование CnE/cdk2 комплекса. В этой же G1 фазе начинает экспрессироваться CnA; и комплекс CnA/cdk2 обеспечивает вступление клетки в следующую (после стадии S) фазу G2 клеточного цикла. Недостаток CnA влечет за собой остановку клеточного цикла в G2. CnB, присутствующий в клетке в течение всей интерфазы, активируется в самом конце фазы G2 и образует комплекс с cdс2, необходимый для начала последней стадии цикла - М фазы. Деактивация CnB приводит к остановке клеточного цикла в фазе G2 [ 12, 33 ].

1.3 Ишемический инсульт и нейрогенез

Ишемический инсульт (инфаркт мозга) развивается при значительном уменьшении мозгового кровотока. На стадии реперфузии, когда мозговой кровоток восстанавливается, происходит интенсификация окислительного стресса, который характеризуется как дисбаланс между продукцией активных форм кислорода и емкостью антиоксидантной защиты. В результате окислительного стресса происходит повреждение липидов, белков и нуклеиновых кислот и гибель клеток мозга по некротическому и/или апоптотическому типу.

Гибернация является уникальным физиологичеким состоянием, при котором происходит снижение метаболизма и температуры тела, обеспечивающие выживание в период дефицита пищи. Значительная степень нейропротекции при гибернации обусловливается комбинацией факторов, играющих важную роль в защите мозга от повреждения при кардинальном изменении мозгового кровотока во время спячки и после пробуждения. Адгезия нейтрофилов и инфильтрация макрофагов в место повреждения стимулируют цитотоксичекие реакции при ишемии мозга. Лейкоцитопения, снижение продукции антител и повышение антиоксидантной защиты могут защищать нейроны от повреждения при гибернации. На моделях фокальной ишемии-реперфузии показано, что ингибирование синтеза белка, которое также наблюдается при гибернации, обладает нейропротекторным действием [ 22 ].

Известно, что в мозге экспериментальных животных после ишемии усиливается нейрогенез, который частично компенсирует нейродегенеративные изменения. Показано, что в моделях на грызунах инсульт, вызванный окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА), запускает усиленный нейрогенез в поврежденном стриатуме и неповрежденном гиппокампе молодых грызунов. В результате экспериментов на животных старшего возраста было показано, что у молодых и старых крыс происходит одинаковое увеличение числа новообразованных нейронов стриатума после инсульта, несмотря на то что базальная пролиферация клеток в субвентрикулярной зоне у старых крыс была снижена [2]. Напротив, число новообразованных после инсульта гранулярных клеток и базальный нейрогенез в субгранулярной зоне зубчатой извилины были ниже у старых животных по сравнению с молодыми. Кроме того, у старых крыс в зубчатой извилине была ослаблена способность новообразованных клеток дифференцироваться в нейроны. Но, тем не менее, величина стриарного постинсультного нейрогенеза сопоставима у молодых и старых животных, что указывает на функционирование этого механизма восстановления также и в пожилом возрасте.