10081 (Морфология и метаболизм дрожжей), страница 3

Крупномасштабное получение этанола в качестве топлива осуществляется в основном в Бразилии и других странах Южной Америки. В качестве источника углеводов используется сахарный тростник и маниока, в качестве продуцента этанола - Saccharomyces cerevisiae.

Перспективным сырьем для получения спирта являются отходы целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности. Однако, гидролизаты древесины содержат большое количество пентоз. До середины 70-х годов XX в. вообще не были известны дрожжи, активно сбраживающие пентозы. Сейчас такие виды найдены: Pachysolen tannophilus и Pichia stipitis (анаморфа - Candida shehatae). Им прочат большое будущее в производстве спирта из гидролизатов древесных отходов, соломы, торфа и т.п.

В небольших масштабах этанол можно получать и из других субстратов, например из молочной сыворотки, используя сбраживающие лактозу дрожжи из рода Kluyveromyces.

Различные продукты, получаемые из дрожжей

В последние десятилетия разнообразие биотехнологических процессов, в которых используются дрожжи, резко увеличилось. Еще более разнообразны перспективы использования дрожжей: в различных разработках, патентах и т.п. упоминается более 200 видов. Сейчас дрожжи используются для получения различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессах.

Промышленно важные органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами, являются либо конечными продуктами (молочная, масляная, пропионовая кислоты у анаэробных бактерий), либо интермедиатами метаболизма. Последние можно получать с помощью дрожжей. В наибольших масштабах производится лимонная кислота, в основном с помощью Aspergillus niger, с использованием в качестве субстрата мелассы. Однако, ее можно получать и с помощью дрожжей на более дешевых субстратах, таких как парафины нефти или этанол. Сейчас разработаны технологии получения и многих других кислот, например, изолимонной из Candida catenulata, фумаровой из Candida hydrocarbofumarica, яблочной из Pichia membranaefaciens и др.

Из дрожжевых полисахаридов наиболее известен пуллулан, который получают из дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans. Он представляет собой β-глюкан, в котором мальтотриозные остатки соединены между собой β (1→6) гликозидными связями. Пуллулан используется в основном в пищевой промышленности в качестве пленочного покрытия. Возможно получение разнообразных по строению и свойствам полисахаридов и из других видов дрожжей. Особенно много внеклеточных полисахаридов образуют дрожжи Cryptococcus, Rhodotorula, Lipomyces.

Многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит) - широко применяются в химической и пищевой промышленности. Перспективным считается способ получения сахароспиртов, таких как глицерин, эритрит и ксилит, с использованием ксеротолерантных дрожжей рода Zygosaccharomyces. Эти дрожжи способны расти в средах с высоким осмотическим давлением, синтезируя при этом большое количество внутриклеточных полиолов, которые служат осмопротекторами. Другой способ касается получения ксилита - важного полиола для пищевой промышленности. Ксилит накапливается как побочный продукт при сбраживании ксилозы дрожжами Pachysolen tannophilus.

Многие дрожжи служат источниками для получения ферментных препаратов, которые используются в современной пищевой и химической промышленности. Из дрожжевого осадка, образующегося как отход пивоварения, получают фермент β-фруктофуранозидазу (инвертазу), расщепляющий сахарозу на глюкозу и фруктозу. Препараты инвертазы широко применяются в кондитерской промышленности для предотвращения кристаллизации сахарозы, для приготовления инвертных сиропов. С помощью культур Kluyveromyces marxianus получают β-галактозидазу, которая применяется в молочной промышленности. Дрожжи Yarrowia lipolytica используются для получения липолитических ферментов, представляющих большой интерес для многих отраслей хозяйства. Липазы используются в сыроварении, в косметической промышленности, при выделке мехов и кож, в моющих средствах. В последние годы разработано множество способов получения самых различных ферментов из дрожжей: пектиназ из Saccharomycopsis fibuliger, амилаз из Schwanniomyces occidentalis, ксиланаз из Cryptococcus laurentii, гидролаз L-α-амино-ε-капролактама из криптококков, алкогольоксидазы из Pichia burtonii, оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, фенилаланинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis. Это лишь немногие примеры получения дрожжевых ферментных, спектр которых в последние годы постоянно расширяется.

Применение дрожжей как источников витаминов началось в 1930-е годы. Одним из первых промышленных процессов получения витаминов было выделение эргостерина из Saccharomyces cerevisiae с последующим облучением ультрафиолетом для перевода в витамин D. Затем у дрожжей была открыта способность к сверхсинтезу некоторых витаминов группы В, в частности рибофлавина. Некоторые красные дрожжи используются для получения каротиноидов, в частности β-каротина, служащего предшественником витамина A, астаксантина, используемого в качестве кормовой добавки в рыбоводстве. Кроме производства индивидуальных витаминов уже много лет в мире практикуется получение автолизатов и гидролизатов дрожжей, питьевых дрожжей, которые используются как источник витаминов и как вкусовые добавки.

Глава 2. Объекты и методы исследований

2.1 Объекты исследований

Объектом исследований является почва, отобранная из различных экониш. Проба №1 – почва поля не посевного (Ахтубинский р-он), проба №2 – почва лесная (Ахтубинский р-он), проба №3 – почва садовая (парк АГТУ), проба №4 – почва луговая (луг заливной, Ахтубинский р-он), проба №5 – почва из грибницы шампиньона (Икряненский р-он).

2.2 Отбор проб

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов. Пробы №1, №2, №3, и №4 были отобраны по одном и тому же методу, с площади 100 м² взяли пробу из трех точек. Верхний слой почвы толщиной 2 см снимается и только после этого отбирается проба почвы. Так проделываем три раза. Проба №5 отбирается из одной точки, из грибницы шампиньона.

2.3 Приборы для взятия проб

Почвенный образец берут буром, лопатой и ножом. В поле перед взятием образца их тщательно очищают, затем обрабатывают спиртом и обжигают. Можно ограничиться очисткой этих предметов, если затем несколько раз воткнуть их в почву изучаемого горизонта. Укладывают образец в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной бумагой, либо в стерильные пергаментные пакеты или пакеты из плотной бумаги, взятой двойным слоем. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и других сведений.

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. При необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение двух дней. Для придания среднему образцу большей однородности, соблюдая все условия асептики, тщательно перемешивают почву, вынимают корни растений, различные включения (Теппер, 1994).

2.4 Методы стерилизации

Стерилизация, или обеспложивание (от лат. sterilis – бесплодный), – это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько методов стерилизации. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием.

Фламбирование, или прокаливание

Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т. д.

Стерилизация сухим жаром

Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов, например крахмала, мела. При этом стерилизуемый объект выдерживают при 170ºС в течение 2 ч (считая с того момента, как установлена необходимая температура) в печи Пастера или в электросушильных шкафах. Поднимать температуру выше 170ºС не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться (буреют, становятся ломкими).

Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, вату, марлю заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда может храниться после стерилизации.

По окончании стерилизации шкаф открывают только после того, как температура снизится до комнатной, иначе стекло может лопнуть.

Стерилизация текучим паром

Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин в течение 3 суток ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.

Стерилизация насыщенным паром под давлением

Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. С его помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду.

Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле – автоклаве. На массивной крышке или сбоку котла находятся кран для выхода пара, манометр и предохранительный клапан. Манометр показывает, на сколько давление пара внутри котла выше нормального. Для предотвращения взрыва при превышении предельного давления срабатывает предохранительный клапан, давая выход пару.

Автоклав используют и для дробной стерилизации текучим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный выход пару (Теппер, 1994).

2.5 Материалы и оборудование

Культуры микроорганизмов, пробирки, колбы, чашки Петри, бактериологические иглы, шпатели, штативы, предметные и покровные стекла, красители, спиртовая горелка.

При любой микробиологической работе: при посевах, при посевах, выделении, пересевах, сохранении чистых культур используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры.

Для стерильной посуды используется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течение 2 часов, при температуре 1700°С (считая с того момента, как температура установилась) в печи Пастера или в электросушильных шкафах (с нагревом до 2000).

Вся посуда перед стерилизацией должна быть вымыта, высушена и завернута в бумагу.

Для заворачивания посуды при стерилизации в автоклаве, используют газетную бумагу (которая не размокает).

Большинство питательных сред стерилизуют насыщенным паром под давлением в автоклавах. Повышение давления в автоклаве повышает температуру пара, образуемого внутри автоклава и следовательно, температуру стерилизации.

2.6 Методы и способы обработки материала

Приготовление почвенной суспензии и посев на среды

На стерильную бумагу отвешивают 10 г почвы. Навеску почвы переносят в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывают 10 мин (лучше на механической качалке) и дают отстояться грубым частицам почвы.

Перед приготовлением суспензии для каждого образца готовят 2 стерильные колбы на 250 мл; одна содержит 100 мл стерильной водопроводной воды, другая – пустая. Водой из первой колбы растертую почвенную массу смывают в пустую стерильную колбу. Колбу с полученной суспензией встряхивают 5 мин, оставляют на 30 с и готовят разведения, содержащие разные концентрации почвы. 1 мл суспензии в первой колбе соответствует разведению 10^-1. Последующие разведения (10^-2; 10^-3; 10^-4; 10^-5; 10^-6 и т. д.) лучше тоже делать в колбах на 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды, но мы использовали пробирки со стерильной водой с 9 мл.

Из каждого предыдущего разведения отдельной стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии и переносят в следующую пробирку с 9 мл воды. Всякий раз пипетку ополаскивают и отставляют. Последующие пробирки встряхивают по 1 мин.

Из полученных разведений делают посев на плотные среды. Набор сред зависит от задач бактериологического анализа почвы. На плотные питательные среды посев проводят преимущественно поверхностно, но мы использовали преимущественно глубинный посев.

При определении количества бактерий в почве использовались следующие среды: Глюкозо-петонная, Глюкозо-аммонийная, Сабуро, Эшби с сахарозой, и МПА.

Для глубинного посева берут 1 мл почвенной суспензии из разведения на порядок меньшего, чем для поверхностного посева.

Суспензию вносят в стерильную чашку Петри, заливают агаром, расплавленным и охлажденным до 45°С, и смешивают с ним. При глубинном посеве показатели получаются более низкие, чем при поверхностном (Теппер, 1994).

2.7 Методы приготовления препаратов микроорганизмов

Техника взятия культуры для приготовления препарата

Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бактериологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.

Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и закрывают пробирку.

Фиксированные препараты микроорганизмов

Вводные пояснения. В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Под фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами (в целях безопасности).

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжиривания стекол используют смесь этилового спирта и серного эфира в соотношении 1:1. Эти операции проводят вдали от горелок. Прокаленной бактериологической иглой из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см².