10081 (600338), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

В случае, если суспензия густая, ее сначала разводят водой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажающей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют (Теппер, 1994).

Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки. Для этого препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки.

Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьирует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски.

При простой окраске используют какой-либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка.

При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Грамму, окраски спор.

Окрашивание препарата по способу Грама

1. Метил-виолет 30 сек.

2. Краску слить самотеком.

3. Высушить мазок фильтровальной бумагой.

4. Налить на 30сек. раствор люголя.

5. Слить самотеком раствор люголя.

6. Обесцвечивать спиртом 15 сек.

7. Промыть препарат водой.

8. Дополнительная окраска - разведенный фуксин 1 мин.

9. Промыть препарат водой, высушить фильтровальной бумагой, микроскопировать с 90* объективом.

2.8 Выделение чистой культуры и проверка на чистоту

Чистые культуры выделялись на среду Сабуро (см. Приложение №1), т.к. она содержит все необходимые питательные вещества для роста дрожжей.

Полученную культуру проверяем на чистоту методом посевов на селективные плотные питательные среды.

2.9 Получение культуральной жидкости

С помощью шпателя отбиралась биомасса культуры дрожжей, затем ее помещали в жидкую питательную среду (Сабуро). Культура инкубировалась в течение 1 недели в аэробных условиях, в данном случае мы использовали «качалку». После инкубации полученная жидкость центрифугировалась и стерилизовалась при 1 атмосфере.

В полученной культуральной жидкости могут присутствовать различные кислоты (молочная, масляная, пропионовая, яблочная), многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит), некоторые витамины группы В, в частности рибофлавина.

Глава 3. Экспериментальная часть

Выделение почвенных дрожжей производилось чашечным методом, путем высева на различные питательные среды. Рецепт среды см. в приложении.

Проба №1 – почва с полевая (не посевная).

Проба №2 – почва лесная.

Проба №3 – почва садовая (парк АГТУ).

Проба №4 – почва с луговая (заливная).

Проба №5 – почва из грибницы шампиньона.

При исследовании проб выявлена следующая закономерность: В пробах под номерами 1, 3 и 4 не было обнаружено дрожжей.

Вероятно это можно объяснить тем, что эти почвы бедны легко доступными элементами питания. На этих почвах очень маленькая растительность, а как нам уже известно в основном они попадают в почв с растительным опадом. Почва не является для них истинным местом обитания, а лишь «ловушкой», местом сохранения или постепенного отмирания.

В пробе №2 на среде Сабуро была обнаружена колония дрожжей со следующими культуральными признаками: круглая, слизистая, с валиков по краю, оранжевого цвета, профиль выпуклый, пигмент в агар не выделяет. Микроскопия: крупные, округлые делящиеся клетки, находящиеся в скоплении, одноклеточного мицелия не образуют. С помощью ключа для определения родов дрожжей предполагается, что данная колония относится к роду Schizosaccharomyces.

На глюкозо-пептонной среде этой же пробы была выделена колония другого рода дрожжей. Культуральные признаки: круглая, бархатистая колония, врастающая в агар, зеленовато-голубого цвета с белым кантом. Микроскопия: крупные клетки образуют мицелий, почкующиеся клетки отсутствуют. С помощью ключа для определения родов дрожжей предположительно установлено, что они относится к роду Galactomyces.

Результаты исследований свидетельствуют, что разлагающиеся растительные остатки: опад, лесные подстилки, отмершие части мхов, торф - представляют собой типичные места обитания многих видов дрожжей. Свежий растительный опад, состоящий из листьев растений, сохраняющих анатомическое строение, практически всегда содержит дрожжи в количестве не меньшем, чем на надземных частях растений. В некоторых случаях численность дрожжей в опаде даже выше, чем на живых частях растений. Плотность заселения дрожжами растительного опада в значительной степени определяется количеством дрожжевых клеток изначально присутствовавших на листьях растений (Максимова, Чернов, 2004.)

С повышением степени разложенности растительных остатков средняя численность дрожжей убывает. В образцах нижних слоев лесной подстилки, перегнойных горизонтах почв дрожжи обнаруживаются далеко не всегда, и численность их может снижаться.

Проба №5

Таблица 1.

Характеристика выделенных культур на среде Сабуро

При исследовании пробы под №5 было выяснено, что в ней находится максимальное количество дрожжей. Основная масса, которых представлена следующими родами Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida.

Результат исследований показывает, что надземные части растений почти заселены эпифитными микроорганизмами, среди которых значительную часть составляют дрожжи. Эти дрожжи - не паразиты растений, а симбионты. Единственный источник питания таких дрожжей – прижизненные выделения растений, в состав которых входят глюкоза, фруктоза, сахароза и различные органические кислоты. Известно, что земля грибницы шампиньона имеет слабо-кислую реакцию среды (рН=5.8-6), влажность составляет около 75%. Также грибница богата легко доступными элементами питания (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm). В ответ дрожжи выделяют различные ростовые вещества, в числе которых витамины, аминокислоты, органические кислоты, ферменты.

Скорость роста маточных культур исследовалась на основе картофельного агара с добавлением культуральных жидкостей из исследуемых образцов:

Образец № 1 – Candida

Образец № 2 – Saccharomysec

Образец № 3 – Galactomyces

Образец № 4 –Saccharomysec

Образец № 5 – Schizosaccharomyces

Интенсивный рост отмечен на среде с добавление культуральной жидкости родов Candida и Saccharomysec (2,4).

Шампиньон 2

Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,4,5.

Огневка

Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,2,4.

Вешенка (Sylvan)

Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,4,.

Зонтик

Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 2,3,5.

Валуй

Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,2.

Шампиньон 1

Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами всех образцов.

По данным характеризующих скорость роста исследуемых маточных культур на картофельном агаре с добавлением культуральной жидкости дрожжей установлено, что лучшие показатели скорости роста у шампиньона 2 и шампиньона 1. Мицелий исследуемых культур более плотный, чем на средах без добавления культуральной жидкости дрожжей. Это можно объяснить тем, что культуральная жидкость содержит рибофлавин являющийся как каталализатором для оптимального роста грибов.

Выводы

1. В ходе проведения экспериментальных исследований различных проб почв на наличие почвенных дрожжей установлено, что видовое разнообразие дрожжей в зависимости от различных условий окружающей среды может изменяться.

2. В результате постановки опыта выделены чистые культуры почвенных дрожжей: Schizosaccharomyces, Galactomyces, Candida, Saccharomyces.

3. Интенсивность роста маточных культур базадиальных грибов на картофельной среде с добавлением культуральной жидкости дрожжей располагаются по убыванию:

Candida → Saccharomyces (2) → Saccharomyces (4) → Schizosaccharomyces → Galactomyces.

Список литературы:

1. http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm

2. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. – М.: Товарищество научных изданий КМК. 2004г., 221с.

3. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.: Изд-во МГУ. - 1989 г., 336с.

4. Зенова Г.М., Степанов А. Л., Лихачева А.А., Манучарова Н.А. Практикум по биологии почв.- М: МГУ, 2002. – 120с.

5. Т.Ф. Черняковская, Т.Г. Добровольская и т.д. Микробиология, Экспериментальные статьи, 2004, том 73, №4, с.576-570.

6. Мишустин Е.Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. – М: Наука, 1972. – 342c.

7. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии / Шильникова В. К., Переверзева Г.И. - М.: Агропромиздат., 1994. - 233 с.

8. Бери Д. Биология дрожжей. – М.:Мир.,1985.

9. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. – М.: изд-во АН СССР., 1954.

Приложение

Среды

Мясопептонный агар (МПА)

К 1 л МПБ добавляют 15–20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления – 100°С, затвердевания – 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Nа₂СО₃ и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара – косяков).

При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.

Глюкозо-пептонная:

Стерилизовать при 0,5 атмосфере.

Характеристики

Список файлов курсовой работы