93315 (Предмет і завдання вивчення гістології з цитологією та ембріологією)

9

Модуль 1. Цитологія, розмноження, ембріологія

Лекція № 1. Тема: Предмет і завдання вивчення гістології з цитологією та ембріологією.

1. Гістологія – вчення про тканини. Історія розвитку. Клітинна теорія.

2. Методи гістологічного дослідження.

3. Основи цитології. Історія розвитку.

4. Біологія клітин: органели, їх будова і функції.

1. Гістологія – вчення о тканинах. Історія розвитку. Клітинна теорія.

Гістологія (histos — тканина, logos — вчення) — в широкому розумінні наука, яка вивчає тонку і найтоншу будову, розвиток та функціонування структур організму тварини і людини.

Термін гіс­тологія вперше введений в науку німецьким вченим К.Майєром в 1819 р. Завдання сучасної гістології полягає у тому, щоб сформува­ти науковий світогляд про єдність органічної природи. Різноманіт­ні методики гістологічних досліджень дають змогу вивчати орга­нізм на різних рівнях — субклітинному, клітинному, тканинному, окремих органів та цілісного організму.

Гістологія належить до морфологічних наук — вчення про форму та будову організмів. Морфологія має тривалу історію, проте лише в XVIII столітті вона оформилася у спеціальну науку. Й.В.Гете пер­ший, у 1796 р., застосував термін «Морфологія», яку він визначив як вчення про форму, утворення і перетворення органічних тіл.

Морфологія тварин (і людини також) являє собою сукупність наук, об'єднаних спільністю об'єкту досліджень. Завданням цих наук є дослідження із застосуванням різних методів усіх проявів форм та структури. Розвиток морфології поділяють на три періоди.

1) Макро­скопічний розвиток морфології припадає на античний період, се­редньовіччя і закінчується початком XIX століття. У цей період структурні зміни в органах при різних хворобах вивчали, виходячи з особливостей їх кольору, розмірів, консистенції тощо.

2) Початок другого (мікроскопічного) періоду розвитку морфоло­гії ознаменувався створенням світлового мікроскопа (XVII—XVIII століття). Перший складний мікроскоп був виготовлений в Голландії чи Англії, тобто в найбільш передових на той час країнах. Роз­витку мікроскопічного періоду сприяла розробка техніки мікроско­пічного дослідження (1787—1869). Прогрес кожної науки є резуль­татом спільних зусиль дослідників різних країн. У XVIII та на початку XIX століть проведено значну кількість досліджень, в результаті яких встановлювали мікроскопічну будову різних органів тварин і рослин.

У розвитку мікроскопічного періоду морфології брали участь багато вчених, які надзвичайно ретельно вивчали й описували най­тоншу будову різних рослинних і тваринних організмів. М.Мальпігі (1671-1675), А Левенгук (1673-1695), Сваммердам (1737), К.Ф.Вольф (1749—1769). Ці вчені поклали початок наукової мікроскопії і про­будили зацікавленість до цієї області знань, тому заслуговують ве­ликої пошани. Мікроскопічний період характеризується значними досягненнями у розвитку гістології, завдяки подальшому удосконаленню мікро­скопічної техніки гістологічного дослідження. Зусиллями великої кількості вче­них різних країн були виявлені найтонші деталі будови клітин і тканин, основні ознаки їх життєдіяльності, зроблено класифікацію. (І.Мюллер, Я.К.Пуркіньє, М.Шлєйден, Р.Ремак, А.Кьолікер, Р.Вірхов).

Великий вплив на розвиток наукової мікроскопії мала клітинна теорія Т.Шванна (1838—1839), яка містила три головних узагальнення: теорію утворен­ня клітин, доказ клітинної будови усіх органів і частин організму й поширення цих принципів на ріст та розвиток тварин та рослин.

Створення клітинної теорії стало важливим явищем в біології, одним із ви­рішальних підтверджень єдності усієї живої природи. Клітинна теорія значно вплинула на розвиток біології, послужила основним фундаментом для розвитку гістології, фізіології, ембріології, медицини та інших наук. Вона дала основи для матеріалістичного розуміння життя, індивідуального розвитку, еволюційного вза­ємозв'язку організмів.

Основні положення клітинної теорії мають велике значення і понині.

Клі­тинна теорія довела, що:

• клітина є елементарною одиницею живого;

• клітини різних організмів гомологічні за своєю будовою, тобто вони мають ядро, цито­плазму, основні органели;

• розмноження клітин відбувається поділом початкової клітини;

• багатоклітинні організми являють собою складні системи клітин, об'єд­нані в цілісні, інтегровані системи тканин та органів, підпорядкованих і пов'я­заних між собою міжклітинними гуморальними й нервовими формами регуля­ції.

3) В 50-х роках ХХ століття інтенсивний розвиток одержала елект­ронна мікроскопія, яка стала початком третього ультрамікроскопічного періоду розвитку морфології.

Теоретичною основою для створення електронного мікроскопа була теорія де Бройля (1924) про хвильову природу речовин та дослідження Буша (1926), який показав, що електричні та магнітні поля, що мають обертальну симетрію, діють як лінзи.

Перший електронний мікроскоп сконструйовано в 1934 р. німецьким вче­ним Є.Руска. Електронна мікроскопія значно поглибила уявлення про найтоншу будову системи органів тварин і рослин, підтвердила положення клітинної теорії про єдність їх будови. Завдяки електронній мікроскопії стало очевидним, що клітина, крім ядра та цитоплазми, містить комплекс ще менших структур, і що в цілому вміст будь-якої клітини являє собою складну систему мембран, філаментів тощо.

Розвиток морфології та її розділів — цитології — науки про будову та фун­кціональне значення клітини, ембріології — яка вивчає закони генезу зародка і процес його розвитку, вчення про походження та функціональне значення тка­нин — власне гістології, та спеціальної гістології — вчення про розвиток, будову та функціональне значення органів і їх систем стало можливим завдяки розвит­ку фізики і хімії.

В навчальному плані спеціальності 6.010200 «Фізична реабілітація» за­значені розділи об'єднані в одну дисципліну — гістологія.

2. Методи гістологічного дослідження.

Розвиток гістології тісно пов'язаний з удосконаленням мікроскопів та роз­робкою методів мікроскопічного дослідження. Сучасна гістологія має різнома­нітні методи дослідження, які дають змогу всебічно вивчати розвиток, будову та функцію клітин, тканин, органів. Основним об'єктом дослідження при цьому є гістологічні препарати, виготовлені із фіксованих структур. Цей метод назива­ють ще методом класичної гістології. Препарат може являти собою мазок (мазок крові, кісткового мозку), відбиток (печінки, селезінки, тимуса тощо), плівки (плеври, очеревини, м'якої мозкової оболонки), тотальні препарати (зародки на ранніх стадіях розвитку, статеві клітини). Постійні гістологічні препарати вико­ристовують у навчальному процесі й наукових дослідженнях.

Процес виготовлення гістологічного препарату полягає в наступному.

Пер­шим етапом у ньому є одержання матеріалу. При цьому шматочки розміром близько 1x1 см³ вирізують гострою бритвою, не травмуючи об'єкту, останній повинен бути свіжим, брати його слід одразу ж після забою експериментальної тварини.

Другим етапом цього процесу є фіксація матеріалу. Її здійснюють відразу ж після вирізування шматочка. Полягає вона в зануренні його в фіксуючу рідину. Метою фіксації є збереження гістологічних структур. Фіксатором може бути 5— 10 % розчин формаліну: він швидко проникає у тканини, добре їх фіксує, легко видаляється після промивання у воді.

Фіксаторами є оцтова, пікринова, осмієва кислоти, нейтральний 10% форма­лін, етиловий та метиловий спирт. При необхідності застосовують різні складні фіксуючі суміші, які містять названі компоненти у різних співвідношеннях.

Третій етап виготовлення гістологічного препарату — зневоднення фіксова­ного матеріалу. Для цього використовують спирти зростаючої концентрації (від 50 до 100 градусів). Після зневоднення матеріал ущільнюється. Його здійснюють у насиченому розчині рідкого парафіну в ксилолі при температурі 37° С, а потім в рідкому парафіні при температурі 55° С. У парафіні об'єкт просочується, йому дають змогу затвердіти при кімнатній температурі разом з парафіном у спеціаль­ній формочці. Блок для електронної мікроскопії одержують ущільненням об'єк­ту в органічних смолах. Зрізи виготовляють на спеціальних приладах-мікротомах (для світлової мікроскопії тонкі зрізи товщиною 8 мкм, напівтонкі 0,5—1 мкм); для електронної мікроскопії ультратонкі зрізи — 0,05—0,2 мкм виготовляють на ультрамікротомах.

Забарвлюють зрізи для збільшення контрастності зображення окремих стру­ктур при розгляді їх у мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур різноманітні. Вибір їх залежить від мети дослідження. Гістологічні барвники за походженням поділяють на кислі, основні та нейтральні. Кислий фарбник — еозин — забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір; це синтетичний фарб­ник. Структури, що фарбуються кислими фарбниками, називають оксифільними. Основні фарбники забарвляюють ядра клітин і тому їх називають ядерними. Прикладом є гематоксилін — фарбник рослинного походження. Він фарбує яд­ро клітини в синьо-фіолетовий колір. Гістологічні структури, що здатні забарв­люватися основними барвниками, називають базофільними. Структури, що

сприймають кислі та основні барвники, є нейтральними. Вони утворюються при сполученні водних розчинів кислого і основного барвників.

У гістологічній техніці знаходять широке використання спеціальні барвни­ки. За їх допомогою фарбують речовини певної хімічної природи. Наприклад, альціановий синій використовують для визначення кислих глікозаміногліканів. Судан III забарвлює нейтральні жирові речовини в оранжевий колір, судан чо­рний В — ліпіди в чорний колір. Для забарвлення нервової тканини успішно користуються методикою імпрегнації азотнокислим сріблом тощо.

Після фарбування зрізи відмивають від залишку фарбника, зневоднюють етиловим спиртом, просвітлюють ксилолом, потім вміщують в тонкий шар ба­льзаму між предметним та покривним скельцями. Бальзам і скельця мають май­же однаковий показник заломлення світла, що запобігає розсіюванню променів при проходженні їх через товщу препарату. Основний недолік цього класичного способу виготовлення препарату — поява штучного утворення — артефакту, що може бути причиною одержання негативних результатів. Однак, знаючи законо­мірності фіксування та зневоднення, артефактів можна уникнути. Так, якщо матеріал довго зберігати у формаліні, у ньому можуть утворитися темні пігмент­ні зерна. Щоб запобігти їх появі, препарат ретельно промивають у проточній воді. Інша справа, коли порушують правила виготовлення препарату, з'явля­ються волокна тканини, якою протирають скельця, пухирці повітря при накри­ванні препарату покривним скельцем, осад фарб, зазубрини мікротомного но­жа, складки зрізу.

Крім основного класичного методу, в гістології існує багато інших, які за­стосовують залежно від мети дослідження. Зокрема це такі методи:

флуоресцентна мікроскопія, яка дає змогу вивчити як власну (первинну) флу­оресценцію речовин, так і вторинну, викликану фарбуванням клітинних струк­тур спеціальними барвниками-флуорохромами. Останні, при взаємодії з різни­ми компонентами клітини, утворюють специфічне світіння відповідних струк­тур. Так, флуорохром — акридиновий оранжевий з ДНК дає зелене світіння, а з РНК — червоне.

Метод темнопольової мікроскопії полягає в тому, що дрібні часточки, які лежать за межами дозволеної здатності мікроскопа, стають видимими в проме­нях, що йдуть під таким великим кутом і в об'єктив вони безпосередньо не потрапляють. В об'єктив потрапляє лише світло, відбите від цих часточок, і вони мають вигляд світлих цяточок по темному фоні. Цей метод є цінним при вивченні живих колоїдів клітини. Є інші, широко використовувані методи: гіс­тохімічний, ауторадіографічний, імуногістохімічний.

Мікрургія клітини і фракціонування клітинних стуктур. При вивченні власти­востей живої клітини значне місце належить так званій мікрургії, яка дає змогу за допомогою спеціальних мікроманіпуляторів здійснювати операції на клітині. Із застосуванням мікрургії вивчають реакції на пошкодження і вилучення її різ­них складових частин — ядра, ядерця, окремих хромосом.

Різновиди мікрургії вивчають локальний вплив на окремі частини хромосом вузького пучка променів (-гамма-променів, протонів, ультрафіолетових).

В цитології вивчають хімічний склад і властивості ізольованих структур та органоїдів клітин. Ізоляції їх досягають шляхом подрібнення тканин у гомогені­заторах, при цьому руйнуються клітинні оболонки. На фракції гомогенат поділяється в результаті центрифугування. Опрацьовані засоби центрифугування го­могенатів у ступінчастому градієнті щільності. При цьому у пробірці нашарову­ються розчини сахарози, що спадають від дна щільності, останнім нашаровуєть­ся гомогенат.

Центрифугування вмісту такої пробірки дає змогу одержати різні фракції по її вертикалі від найважчих (ядра, ядерця), які опускаються на дно і найлегших, які розміщуються ближче до поверхні (рибосоми, хромосоми, лізосоми).

Цитоспектрофотометрія дає змогу визначити кількісний вміст речовин у клі­тині та їх складових елементів по поглинанню ними світлових променів певної довжини хвилі.

Авторадіографія. За цим методом аналізують розміщення у клітинах і ткани­нах речовин, які помічено радіоактивними ізотопами. Методом авторадіографії виявляють місця синтезу певних речовин, склад білків, шляхи внутрішньоклі­тинного транспорту. Ізотопи, введені в клітини, відновлюють бромисте срібло фотоемульсії, що покриває зріз. Після проявлення фотоемульсії помітні зерна срібла (треки), що свідчить про розміщення в клітинах мічених речовин.

Імуноцитохімічний метод дослідження. Для вивчення деяких складових біл­кового обміну користуються здатністю високомолекулярних речовин-антигенів викликати в клітинах утворення захисних глобулінів (антитіл) і з'єднуватися з ними в комплекси. Приєднання до одного глобуліну флуоресціюючої речовини дає змогу виявити локалізацію іншого.

Гістохімічні методи дослідження. З їх допомогою виявляють хімічну природу складових елементів клітин і міжклітинної речовини, тканин тваринного органі­зму. В основі гістохімічних методів застосовують специфічні хімічні реакції. За їх допомогою виявляють нуклеїнові кислоти, білки, амінокислоти, ліпіди, вугле­води, ферменти.