Программа экзамена молекулярной биологии

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

П Р О Г Р А М М А

экзамена по курсу «Молекулярная биология»

Москва, 2004 г.

Программа составлена сотрудниками кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

зав. кафедрой, академиком РАН А.С. Спириным,

профессором кафедры, чл.-корр. РАН В.А. Гвоздевым,

профессором кафедры И.А. Крашенинниковым

при участии д.б.н. Е.С. Надеждиной и д.б.н. В.И. Цетлина.

Издание подготовлено к печати Экоцентром МГУ на средства гранта «Интеграция»

(Госконтракт № ИОО35; руководитель – профессор кафедры А.А. Колесников,

Отв. исполнитель – н.с., к.б.н. Ю.В. Малеева) при активном участии в.н.с., к.б.н.

Н.А. Шаниной и ст. преп., к.б.н. Т.М. Ермохиной.

Для студентов 4-го курса физиолого-биохимического отделения биологического факультета МГУ, аспирантов и соискателей по специальности 03.00.03 – молекулярная биология.

Утверждено на заседании Ученого Совета Биологического факультета МГУ

им. М.В. Ломоносова. Протокол № 11 от 7 декабря 2004 года

Кафедра Молекулярной биологии

Биологического ф-та МГУ

Часть I. Молекула ДНК. Процессы репликации, рекомбинации, репарации, и транскрипции. Регуляция экспрессии генов.

1. Молекула ДНК.

История доказательства генетической функции ДНК. Опыты Эвери, Херши и Чейз. Физические свойства молекулы ДНК. Конформационные формы ДНК A, В, и Z, их физические параметры. Неканоническая H-форма ДНК. Денатурация и ренатурация ДНК. Hуклеотидные последовательности ДНК, определяющие конформацию ДНК, гибкость или жесткость молекулы. Комплементарные пары оснований Уотсона-Крика и Хугстина. Триплексы. Кольцевые молекулы ДНК и понятие о сверхспирализации ДНК. Параметры сверхспирализованной и конформационные переходы в сверхспирализованной молекуле ДНК. Топоизомеры ДНК. Топоизомеразы и их типы. Механизмы действия топоизомераз. ДНК-гираза бактерий.

2. Репликация ДНК у бактерий.

Полимеразы, участвующие в репликации, характеристика их ферментативных активностей. Точность воспроизведения ДНК. Роль стерических взаимодействий между парами оснований ДНК при репликации. Полимеразы I, II и III E.coli. Субъединицы полимеразы III. Понятие о процессивности ДНК полимераз. Полимеразы ("мутазы"), обеспечивающие неточное воспроизведение ДНК. Вилка репликации, "ведущая" и “отстающая” нити при репликации. Фрагменты Оказаки. Координации синтеза ДНК на комплементарных нитях. Комплекс белков в репликационной вилке. Регуляция инициации репликации у E.соli. Структура участка старта репликации (origin, ori). Структурные переходы ДНК в районе старта репликации. Репликатор. Понятие о репликоне. Роль метилирования ДНК в регуляции репликации. Терминация репликации у бактерий. Расхождение ori хромосом перед делением бактериальной клетки. Особенности регуляции репликации плазмид. Двунаправленния репликация и репликация по типу катящегося кольца.

3. Репликация ДНК у эукариот.

Репликативные ДНК-полимеразы. Праймаза-ДНК-полимераза. Фрагменты Оказаки и особенности их “процессинга”. Pепликоны эукариот, изменчивость их размеров. Понятие о стационарныхх "репликативных фабриках". Старты репликации (оri) у дрожжей, их структурно-функциональная организация. Изменчивость сайтов ori у многоклеточных эукариот. Ошибки репликации, обусловленные скольжением нитей при репликации. Механизм образования коротких повторов. Микросателлиты и минисателлиты. Короткие тандемные повторы, определяющие геномный рестриктный полиморфизм. "Экспансия триплетов" и "динамичные мутации".

4. Peпликация ДНК и клеточный цикл.

Молекулярные механизмы, координирующие клеточный цикл и репликацию ДНК. Понятие о “сверочных точках” (checkpoints). Циклины и протеинкиназы. Протоонкогены, участвующие в регуляции клеточного цикла. “Расписание репликации” участков хромосомы в клеточном цикле. Молекулярные механизмы, препятствующие новой инициации репликации до завершения клеточного цикла. Случаи локальной амплификация участков ДНК эукариот, ее возможные механизмы. Механизмы упаковки ДНК при подготовке к делению клетки. Когезины и конденсины в расхождении и упаковке хромосом.

5. Структурно-функциональные элементы хромосом эукариот: теломера и центромера.

Проблема репликации линейного незамкнутого фрагмента ДНК. Теломера и теломерные повторы. Теломераза, ее РНК-компонент. Теория старения в связи с динамикой структуры теломеры. Регуляция длины теломеры. Структура ДНК (теломерная петля) и специфические белки в районе теломерных последовательностей. ДНК в районе центромеры, особенности структурной организации. Кинетохор. Искусственные хромосомы эукариот.

6. Репарация ДНК.

Классификация типов репарации. Прямая репарация тиминовых димеров и метилированного гуанина. Вырезание оснований. Гликозилазы. Урацилгликозилаза. “Внеспиральное узнавание” оснований ферментами репарации. Вырезание (эксцизия) поврежденных нуклеотидов. Комплекс ферментов, осуществляющих эксцизионную репарацию. Mexанизм репарации, направленной на исправление активно транскрибируемых генов. Механизм репарации неспаренных нуклеотидов (mismatch репарация). Выбор репарируемой нити ДНК. SOS-репарация. Свойства ДНК полимераз, участвующих в SOS-репарации (ДНК-мутазы), у прокариот и эукариот. Представление об “адаптивных мутациях” у бактерий. Репарация двухнитевых разрывов: гомологичная пострепликативная рекомбинация и объединение негомологичных концов молекулы ДНК. Сигналы, обеспечивающие репарацию двухнитевых разрывов и задержку репликации ДНК до завершения репарации. Болезни, обусловленные дефектами разных систем репарации.

7. Общая, или гомологичная рекомбинация.

Двухнитевые разрывы ДНК, инициирующие рекомбинацию. Роль рекомбинации в пострепликативной репарации двухнитевых разрывов. Структура Холлидея в модели рекомбинации. Миграция ветви, гетеродуплексы, “разрешение” структуры Холлидея. Постмейотическая сегрегация у дрожжей как доказательство возникновения гетеродуплекса при рекомбинации. Энзимология общей рекомбинации у E.coli. RecBCD комплекс. RecA белок. Пресинаптическая нить, параметры ее молекулярной структуры. Обмен нитей ДНК при синапсе. Особенности “миграции ветви”. Ферменты, участвующие в миграции ветви и разрешении структуры Холлидея. Роль pекомбинации в обеспечении синтеза ДНК при повреждениях ДНК, прерывающих репликацию. Рекомбинация у эукариот. Ферменты рекомбинации у эукариот. Ортологи RecA белка. Синаптонемный комплекс. Генная конверсия, ассиметричность генной конверсии. Локус спаривания у дрожжей, переключение типов спаривания.

8. Сайт-специфичная рекомбинация.

Различия молекулярных механизмов общей и сайт-специфичной рекомбинации. Классификация рекомбиназ. Типы хромосомных перестроек, осуществляемых при сайт-специфичной рекомбинации. Регуляторная роль сайт-специфичной рекомбинации у бактерий. Конструирование хромосом многоклеточных эукариот с помощью системы сайт-специфичной рекомбинации фага.

9. ДНК-транспозоны в геномах прокариот и эукариот.

IS-последовательности бактерий, их структура. IS-последовательности как компонент F-фактора бактерий, определяющего способность передачи генетического материала при конъюгации. Транспозоны бактерий (Tn3, Tn5, Tn9 и Tn10). Прямой нерепликативный и репликативный механизмы транспозиций. Резольваза и ее функции при репликативной транспозиции. Роль сверхспирализации при транспозиции. Регуляция транспозиций Tn10. ДНК-транспозоны у эукариот. Двухкомпонентная система ДНК-транспозонов: автономный и дефектный транспозоны. Транспозоны кукурузы и дрозофилы. Влияние транспозонов на активность генов. Представление о горизонтальном переносе транспозонов и их роли в структурных перерстройках (эктопическая рекомбинация) и в эволюции генома. Представление о роли транспозонов в возникновение иммунной системы.

10. Подвижные элементы, перемещающиеся с помощью обратной транскрипции (ретроэлементы).

Классификация ретроэлементов. Различие механизмов перемещения элементов с длинными концевыми повторами (ретротранспозонов и ретровирусов) и LINE-элементов. Ty элементы в геноме дрожжей. Элементы L1 и Alu в геноме человека. Ретротранспозоны и эволюция геномов. Ретрогены, или “процессированные гены” и псевдогены. LINE элементы теломер геноме дрозофилы. Подвижные интроны дрожжей.

11. Транскрипция у прокариот.

РНК-полимераза прокариот, ее субъединичная и трехмерная структуры. Разнообразие сигма-факторов. Сигма-54 и особенности регуляции гена глутаминсинтазы. Промотор генов прокариот, его структурние элементы. Стадии транскрипционного цикла. Инициация, образование “открытого комплекса”, элонгация и терминация транскрипции. Сверхспирализация и транскрипция. Аттенюация транскрипции. Регуляция экспрессии триптофанового оперона. “Рибопереключатели”. Механизмы терминация транскрипции. Полярные мутации. Негативная и позитивная регуляция транскрипции. Лактозный оперон. CAP-белок. Регуляция транскрипции в развитии фага лямбда. Принципы узнавания ДНК регуляторными белками (САР-белок и репрессор фага лямбда). Принципы аутогенной регуляции и кооперативности на примере регуляции экспрессии репрессора фага лямбда.

12. Транскрипция у эукариот.

РНК-полимеразы эукариот I, II и III. Участие разных полимераз в транскрипции разных клеточных РНК. Регуляция транскрипции полимеразой II. Понятие о цис- и транс-регуляции транскрипции. “Модули” промоторов полимеразы II у эукариот. Базальная транскрипция и ее факторы. ТBP и TAF факторы. Узнавание ДНК фактором TBP. Медиатор. Ковалентная модификация факторов транскрипции. Фосфорилирование субъединиы РНК-полимеразы II и элонгация транскрипции. Белки - активаторы транскрипции, их доменные структуры. Типы доменов, узнающих регуляторные цис-действующие элементы. Комбинаторный принцип в регуляции транскрипции. Коактиваторы и корепрессоры Энхансеры и энхансеосома. Принцип “дальнодействия” в регуляции транскрипции. Локус-контролирующие районы и "инсуляторы". Методы "обратной генетики" в развитии представлений о регуляции транскрипции у эукариот. Полимеразы I и III. Особенности структуры промоторов генов, транскрибируемих с помощью этих полимераз.

13. Пространственная организация хромосом в ядре и регуляция генной активности.

Представление о петельной организации хромосом. Ядерный матрикс. Белки–ламины внутренней ядерной мембраны и их участие в инактивации генов. Хромосомные территории в интерфазном ядре. Особенности пространственной внутриядерной структуры хромосом и активность генов.

14. Регуляция транскрипции в развитии эукариот.

Гомеодомены регуляторных белков и явление гомейозиса. Комбинаторние механизмы, обеспечивающие специфичность взаимодействий гомеодоменов с регуляторными модулями ДНК. Гены-мишени гомеодоменных белков. Принципы структурной организации и регуляции активности генов HOX-кластеров, определяющих план строения тела. Транскрипционные факторы как морфогены в развитии многоклеточных организмов. Понятие о позиционной информации. Механизмы возникновения пространственно ограниченных морфогенетических градиентов факторов транскрипции. Особенности структуры промоторов генов, ответственных за сегментную экспрессию белков-морфогенов в развитии дрозофилы.

15. Гормональная регуляция и сигнальние системы, регулирующие экспрессию генов.

Внешние сигналы (митогенные факторы, гормоны), регулирующие транскрипцию генов. Примеры систем передачи сигналов. Семейства белков Jun и Fos, кодируемых протоонкогенами. STAT белки. AP1 и CRE сайты в промоторах генов. Белки-коактиваторы семейства 300/CBP. Ядерные рецепторы гормонов, их домены, особенности “узнавания” ими регуляторных последователностей ДНК. Глюкокортикоидний и тиреоидный рецепторы, рецептор экдистерона, ретиноевой кислоты и ее метаболитов. Гетеродимеры рецепторов, ответственных за разнообразие физиологических эффектов, индуцированных гормонами. Рецепторы-сироты. Интеграция воздеиствий стероидных гормонов и митогенных факторов.

16. Структура хроматина.

Нуклеосома как единица структурной организация хроматина. Хроматосома. Октамер гистонов в составе нуклеосомы. Линкер и линкерные гистоны. Нуклеосомы и транскрипция. “Трансляционное” и “ротационное” позиционирование ДНК на гистоновой глобуле. Сборка нуклеосом при репликации ДНК, ее этапы, нуклеоплазмин. Варианты белков-гистонов. Замещение вариантов гистонов без репликации ДНК. Структура хроматина в районах инициации репликации. Модификация структуры хроматина и процессы репарации.

17. Хроматин и регуляция активности генов.

Химические модификации гистонов: aцетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквитинилирование и ADP-рибозилирование. Понятие о ”гистоновом коде”. Активный и неактивный хроматин. Механизмы репрессии генов, обусловленные деацетилированием и метилированием гистонов. АТР-зависимоe "ремоделированиe" хроматина. Молекулярные машины ремоделирования. Роль нуклеосомных структур в активации экспрессии гена. Системная регуляция генов Х-хромосом на уровне хроматина у млекопитающих и дрозофилы. Некодирующая РНК как структурный компонент хроматина. Короткие РНК (21-23 нуклеотида) в организации структуры неактивного хроматина. Хроматин и гетерохроматин. Распространение гетерохроматинизации по хромосоме. Варианты гистонов нуклеосом, препятствующие гетерохроматинизации.

18. Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии ренов.

Модификация гистонов как сигнал для метилирования ДНК. Механизмы инактивации генов при метилировании ДНК. Репликативное метилирование ДНК. Дезаминирование 5-метилцитозина и мутации. ДНК-метилтрансферазы эукариот. Наследование метилированного состояния и метилирование de novo. “Родительский” геномный импритинг как эпигенетическая регуляция экспрессии генов. Характер метилирования ДНК, его изменчивость в развитии млекопитающих. Эффекты положения генов. Белковые комплексы в определении эпигеномного наследования.

19. Процессинг РНК.

Кепирование, сплайсинг и полиаденилирование транскриптов, синтезируемых полимеразой II. Механизмы сплайсинга. Роль малых ядерных РНК и белковых факторов. Сплайсосома. Альтернативный сплайсинг, примеры. Энхансеры сплайсинга. Каскады альтернативного сплайсинга и регуляция половой дифференцировки у дрозофилы. Биологическая роль альтернативного сплайсинга, примеры. Роль белков, связывающихся с РНК-полимеразой на промоторе, в определении специфичности сплайсинга. Сплайсинг и его роль в определении специфичности функционирования мРНК в цитоплазме. “Контроль качества” пре-мРНК в ядре. Сопряжение транскрипции, сплайсинга и транспорта РНК из ядра в цитоплазму. Ядерные поры. Транс-сплайсинг, его распространение. “Самосплайсинг”. Процессинг тРНК и рРНК у про- и эукариот. РНКаза Р как рибозим при процессинге предшественников тРНК. Метилирование рибозы и образование псевдоуридина. Роль малых ядрышковых РНК. Интроны групп 1 и 2. Интроны группы 1 как рибозимы. Редактироввание РНК. Типы редактирования. Инсерции уридиловых остатков, дезаминирование урацила и аденина. Редактирование двухцепочечных участков РНК. Редактирование и регуляция сплайсинга.

Рекомендуемая литература:

1. «Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот». 1990

2. Хесин Р.Б. «Непостоянство генома». Наука 1984

3. М.Сингер, П.Берг. «Гены и геномы». Мир. 1998. т.2

4. Льюин. «Гены». Мир. 1987

5. Патрушев Л.И. «Экспрессия генов». М. Наука. 2000

6. Жимулев И.Ф. «Общая и молекулярная генетика». 2003

7. Щелкунов С.Н. «Генетическая инженерия». 2-е изд. Новосибирск: Сиб.унив.

изд-во.2004.

1. Соросовский образовательный журнал (статьи А.А.Богданова, В.А.Гвоздева,

В.М.Глазера, И.Ф.Жимулева, Л.И.Корочкина, В.Н.Сойфера)