Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза класса I как белок ответа на стресс в E.coli, страница 2

Выявление функциональной роли FbaB в E.coli.

(Исследовательский проект)

Как описано в обзоре литературы, альдолазаFbaB в E.coliлибо участвует в процессе перехода от нормальной жизнедеятельности к выживанию в экстремальных условиях, либо выполняет определённую функцию в тех реакциях, которые необходимы клетке лишь в период стресса. Мобилизация FbaB в конкретных видах стресса и механизмы участия этого белка в адаптации неизвестны. Чтобы ответить на эти вопросы, в проекте предполагается выполнить следующие исследования:

1. Определить виды стресса, к которым клетка E.coli может адаптироваться с помощью FbaB. Для этого планируется сравнить скорость роста культур двух штаммов E.coli - нативного и с нокаутом гена, кодирующего FbaB - в различных стрессовых условиях.

2. На каком именно этапе клеточного цикла FbaB участвует в адаптации к выявленному виду стресса. Для этого планируется определение уровня экспрессии FbaB в лизате клеток нативного штамма E.coli на разных стадиях роста культуры.

3. Требуется ли для адаптации каталитическая активность FbaB. Для этого планируется определение каталитической активности FbaB на разных стадиях роста культуры.

4. В дальнейшем для выявления факторов, совместно с которыми действует FbaB, потребуется определение состава ее белковых партнеров на разных стадиях роста клеток.

5. В литературе имеются сведения о возможной пост-трансляционной модификации FbaB, а именно, ацетилирования по остаткам лизина, которое может выполнять регуляторную функцию [10]. Поэтому в задачи исследования можно включить исследование состава возможных модификаций белка в зависимости от стадии роста клеток, а также определение мест присоединения этих модификаторов.

1. Определение видов стресса, в ответе на которые в E.coli может участвовать FbaB

Установление участия FbaB в реакции клеток на разные виды стресса invivo возможно с помощью эксперимента на штамме E.coli, нокаутном по гену FbaB. Эксперимент заключается в наблюдении роста культуры модифицированной E.coli в условиях определённого стресса (параллельно с контрольным образцом, в качестве которого будет взята культура немодифицированного штамма). Скорость роста планируется определять спектрофотометрически, отбирая пробы заражённой среды через каждые 10-30 мин и регистрируя мутность клеточной суспензии, которая пропорциональна концентрации клеток.

Возможно включить в опыт, кроме нокаутного по FbaB штамма и дикого типа, штаммы с нокаутом каких-либо других генов стрессовых белков, конкретная функция которых в адаптации уже была установлена. Это позволит оценить степень задействования альдолазыFbaB в приспособлении к экстремальным условиям: является ли она незаменимым стрессовым белком или же вспомогательным, отсутствие которого компенсируется повышенной экспрессией других белков со сходной функцией.

Прежде чем приступать к измерениям роста культур в условиях стресса, необходимо сравнить жизнеспособность нокаутного по FbaB и нативного (WT) штаммов в некоторых базовых условиях роста (в отсутствие стрессовых факторов). Мы планируем использовать в качестве базовых следующие условия: среда LB, 5% NaCl, 37C. У нативного штамма E.coli, выращенного в таких условиях, экспрессии FbaB не обнаружено. Поэтому можно ожидать, что различия в скорости роста на этой среде при стрессе у нокаутного штамма и WT будут вызваны именно стрессовыми условиями.

В качестве исследуемых стрессовых условий целесообразно выбрать как условия, в которых экспрессия FbaB достоверно увеличивается (согласно данным литературы), так и условия, про которые этого неизвестно. Интерес для исследования в первую очередь представляют следущие модификации базовых условий:

1. Отличные от глюкозы источники углерода. В культуре E.coli, выращенной на глюкозо-содержащей среде, альдолазыFbaB не обнаружено. В то же время на источниках, отличных от сахаров (пирувате, лактате), существует повышенная экспрессия FbaB. Если FbaB, как предполагается в литературе, играет основную роль в синтезе глюкозы из неуглеводных источников (т.е. в глюконеогенезе), то логично ожидать, что рост культуры нокаутного штамма в этих условиях будет подавлен. В данном опыте предлагается использовать в качестве источников углерода как неуглеводные органические соединения (глицерин, ацетат), так и сахара (например, мальтозу и маннозу). Таким образом, можно будет сделать вывод о том, действительно ли основная роль FbaB заключается в активации глюконеогенеза или же её функция несколько иная.

2. Стационарная фаза. Данный этап роста клеточной культуры относится к стрессовым условиям, т.к. на этой стадии роста концентрация питательных веществ в среде значительно снижается. Основным источником углерода на этой стадии служит ацетат и другие карбоновые кислоты. Этот эксперимент позволит сравнить поведение нокаутного по FbaB и нативного штаммов в условиях более глобального голодания, т.к. в стационарной фазе снижена концентрация и других важных элементов – фосфора, магния и т.д.

3. Анаэробные условия. Ряд метаболических процессов у бактерий при нехватке кислорода принципиально меняется. Это вызвано изменением экспрессии разнообразных регуляторных и эффекторных белков, срели которых (по данным для M. tuberculosis) и альдолазаFbaB. В E.coli этого не было показано. Если и в E.coliFbaB участвует в переходе от аэробной жизнедеятельности к анаэробной, либо собственно в анаэробном метаболизме, то в обоих случаях будет наблюдаться снижение скорости роста у нокаутного штамма по сравнению с контролем.

4. Планируется изучить поведение нокаутного по FbaB штамма E.coli в ряде нестандартных условий, влияние которых на выработку белка FbaB до сих пор не было исследовано:

- Кислый стресс (как сильнокислый, pH около 4, так и умеренный, pH 6-6,5).

- Присутствие токсичных ионов (например, ионов тяжелых металлов).

- Окислительный стресс.

- Аномальные температурные условия (перегрев и переохлаждение в пределах жизнеспособности E.coli).

2. Определение экспрессии FbaB на разных стадиях клеточного цикла

Таким образом, в результате первого этапа исследования будет определен вид стресса, в адаптации к которому участвует альдолазаFbaB. Второй этап будет заключаться в выяснении того, нужна ли для адаптации каталическая активность FbaB или белок выполняет какую-либо другую функцию. Для этого в выбранных условиях в лизате клеток нативного штамма будет определена экспрессия FbaB на разных стадиях роста, а также ее каталитическая активность. Можно также запланировать измерение некоторых параметров, характеризующих интенсивность отдельных ветвей метаболизма, например, интенсивность фосфорного или углеводного обмена, и сравнить их для нативного и нокаутного штаммов.

Уровень экспрессии белка характеризуется концентрацией мРНК, соответствующих данному белку. Измерение проводят с помощью выделения всей РНК из пробы клеток; затем, после обработки ДНКазой, в образец РНК запускается олигонуклеотид ДНК, меченый флюорофором и идентичный ОРС данного белка. По интенсивности свечения определяют концентрацию РНК, т.е. уровень экспрессии белка.

3. Определение активности FbaB на разных стадиях клеточного цикла

Измерение альдолазной активности в пробе WT культуры в разные моменты времени планируется проводить следующим образом: отобранная проба клеток будет лизирована, клеточный дебрис удален центрифугированием, к клеточному экстракту будет добавлен ЭДТА – хелатор ионов металлов, ингибирующий альдолазу класса II, - и в аликвоте экстракта будет измерена альдолазная активность. В качестве контроля можно параллельно измерять активность в присутствии NaBH₄, который необратимо подавляет активность FbaB, но не влияет на активность альдолазы класса II (FbaА).

Для более полной характеристики того, каким образом FbaB участвует в адаптации клетки к стрессу, измерения уровня экспрессии и активности следует проводить:

- в контрольной культуре, условия роста которой отличаются от таковых у исследуемой пробы только отсутствием стрессового фактора;

- в начале индукционного периода, т.е. почти сразу после высева бактерий из ночной культуры в среду со стрессовым фактором;

- ближе к концу индукционного периода;

- в фазе экспоненциального роста.

4. Локализация пространственного распределения FbaB в клетке

Некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что FbaB может участвовать в образовании филаментов прокариотического цитоскелета, который необходим на начальных этапах синтеза клеточной стенки и во многом определяет форму клеток, а также на стадии клеточного деления. Поэтому в данный проект можно включить микроскопическое исследование формы клеток нативного и нокаутного штаммов, в частности, в тех условиях, в которых скорости их роста различаются. Для ещё более детального выяснения того, какова роль FbaB в E.coli, нужно сравнить штамм, нокаутный по FbaB, с нативным по ряду фенотипических признаков: размерам клеток, фактуре оболочки, двигательной способности, наличию пилей и т.п.

Необходимо также определить субклеточную локализацию FbaB на разных стадиях клеточного цикла. Для этого необходимо получить штамм клеток E.coli, в котором FbaBэкспрессировалась бы в виде фьюжн-белка с маркерным белком (в качестве которого можно взять зеленый флюоресцентный белок GFP). В библиотеке имеется плазмида с таким геном, поэтому в данном проекте достаточно трансформировать ее в подходящий штамм и подобрать условия ненулевой экспрессии. Выделять и очищать фьюжн-белок нет необходимости. Клеточную культуру этого штамма предполагается выращивать в базовых условиях (для сравнения) и в стрессовых условиях, в которых наблюдался замедленный рост нокаутного штамма. На разных стадиях клеточного роста препараты этого штамма будут проанализированы методом электронной микроскопии с флуоресцентной детекцией для локализации FbaB внутри клеток.

5. Выявление белковых партнёров FbaB в E.coli

Очевидно, FbaB в клетке взаимодействует с рядом белковых партнёров. Те из них, синтез которых регулируется общим репрессором или активатором (а также расположенные с FbaB в одном опероне), можно обнаружить измерением уровня экспрессии различных белков в FbaB-нокаутном штамме и в контроле. Это измерение производится с помощью специального протеомного анализа, основанного на выделении и разделении суммарного белкового препарата для двух разных штаммов. Разделение проводится с помощью двумерного гель-электрофореза, белковые пятна прокрашиваются специальными флуорогенными красителями, после чего идентичные по положению пятна в двух штаммах сравниваются по интенсивности. Различие в экспрессии более чем в 2 раза может указывать на функциональную связь данного белка и FbaB.

Для выявленных белков можно получить (или использовать готовые) штаммы, нокаутные по их гену, и протестировать их на отношение к стрессу. Если культура нокаутного по изучаемому белку штамма замедляет рост при тех же условиях, что и нокаутнаяпо FbaB, то можно с большей уверенностью утверждать, что данный белок функционально связан с FbaB в ходе ответа на этот стресс.

Для выявленных функциональных партнеров FbaB необходимо будет провести эксперименты, доказывающие их физическое взаимодействие. Для этого можно использовать, например, метод металлоаффинной хроматографии: один из белков- партнеров экспрессируют с аффинным тагом (например, вставкой из шести остатков His на конце полипептидной цепи), смешивают с вторым белком и наносят на колонку с аффинным сорбентом (например, Ni-хелатирующей смолой). В случае физического взаимодействия между белками они оба будут удерживаться на смоле и смываться с нее только при особых условиях (например, высокой концентрации имидазола).

Данное исследование позволит более определённо указать роль FbaB в жизнедеятельности E.coli в условиях того или иного стресса, а также, возможно, выяснить ее участие в других клеточных процессах. Сведения о функции FbaB как стрессового белка могут послужить основой для выдвижения гипотез о конкретных механизмах реакции клетки на стресс. Это поможет открыть и исследовать химические процессы, к катализу или регуляции которых способен этот фермент invivo, что может послужить основой для создания новых антибактериальных средств.

Влияние нокаута гена fbaB на адаптацию E.coli к различным видам стресса.

(Экспериментальная часть)

В данной работе был начат эксперимент по изучению выживаемости штамма E.coli с нокаутом гена fbaB (ΔfbaB) в условиях стресса. В качестве контроля использовали нативный штамм, а также ряд штаммов с нокаутом генов известных стрессовых белков.

Оборудование и реактивы.

Культуры штаммов E.coli, нокаутных по следующим генам: fbaB, gadA, kduI, lpd, ulaB, а также культуру контрольного нативного штамма E.coli брали из библиотеки модифицированных штаммов (…). Для приготовления среды LB применяли готовую сухую смесь реагентов. Клеточные культуры выращивали в инкубируемом шейкере фирмы (…). Измерения светопоглощения вели на спектрофотометре Pharmacia LKB Ultrospec Plus.

Методики.

1. Выращивание ночной культуры. Для выращивания ночной культуры готовили среду LB из расчёта 1 г готовой смеси экстрактов на 40 мл дистиллированной H₂O. Среду стерилизовали автоклавированием в течение 1 часа. В стерильные бакпечатки помещали по 1,5 мл стерилизованной среды. В 5 из них (кроме контрольной) добавлялось по 3 мкл 25 % раствора канамицина. Заражали среду соответствующим штаммом и инкубировали в течение ночи при 37˚С при перемешивании.

2. Выращивание культуры штаммов E.coli в нормальных условиях. В стерильные пробирки помещали по 3,5 мл стерильной среды LB, добавляли в каждую по 25 мкл ночной культуры соответствующего штамма и ставили в инкубируемый шейкер на 37˚С. После 2 часов инкубации каждые 20-25 мин из пробирки отливали около 1 мл клеточной суспензии и измеряли светопоглощение при длине волны 600 нм. Строили графики зависимости D₆₀₀ от времени инкубации и по прямым участкам определяли тангенс угла наклона, соответствующий скорости роста культуры данного штамма.

3. Выращивание культуры штаммов E.coli в стрессовых условиях. Опыт проводили аналогично п. 2, за исключением состава среды. В первом варианте (сильнокислая среда) брали по 4,5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 6,1, и добавляли в каждую по 30 мкл ночной культуры соответствующего штамма. Во втором варианте (умеренно кислая среда) брали по 4,5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 4,5.

Результаты.