Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза класса I как белок ответа на стресс в E.coli

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Химический факультет

Кафедра химии природных соединений

ФРУКТОЗО-1,6-БИСФОСФАТАЛЬДОЛАЗА КЛАССА I

КАК БЕЛОК ОТВЕТА НА СТРЕСС В E.COLI

(Обзор литературы + исследовательский проект)

Курсовая работа

по химической биологии

студентки 110 группы

Гасановой Д.А.

Научный руководитель:

к.х.н., доцент

Р

Москва 2012 г.

одина Е.В.

Оглавление

		Стр.
	Список использованных сокращений	3
1.	Введение	4
2.	Обзор литературы: Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза класса I как возможный белок ответа на стресс в Е. coli	4
2.1.	Классификация альдолаз	4
2.2.	Экспрессия FbaB в различных организмах	6
2.3.	Предполагаемые функции FbaB в бактериальной клетке	8
3.	Исследовательский проект: Выявление функциональной роли фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы класса I в E.coli	9
3.1.	Определение видов стресса, в ответе на которые в E.coli может участвовать FbaB	10
3.2.	Определение экспрессии FbaB на разных стадиях клеточного цикла	11
3.3.	Определение каталитической активности FbaB на разных стадиях клеточного цикла	12
3.4.	Локализация пространственного распределения FbaB в клетке	12
3.5.	Выявление белковых партнёров FbaB в E.coli	13
4.	Экспериментальная часть: Влияние нокаута гена FbaB на адаптацию E.coli к различным видам стресса	14
4.1.	Оборудование и реактивы	14
4.2.	Методики	14
4.3.	Результаты	15
5.	Список литературы	16

Список использованных сокращений.

FbaA – фруктозо-1,6-бифосфатальдолаза класса II (белок)

FbaB – фруктозо-1,6-бифосфатальдолаза класса I (белок)

fbaB – ген, кодирующий FbaB

ΔfbaB – штамм клеток E.coli с нокаутом гена fbaB

WT – нативный штамм E.coli

FBP­­– фруктозо-1,6-бисфосфат

GFP – зелёный флюоресцентный белок

LB – среда Луриа-Бертани, стандартная для культивирования клеток E.coli

ЭДТА ­– этилендиаминтетраацетат

1. Введение

Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы – ферменты, участвующие в гликолизе и глюконеогенезе. Они присутствуют во всех известных живых организмах и подразделяются на два класса, I и II, различающиеся по структуре и механизму каталитического действия. Большинство эубактерий в качестве основной (или единственной) гликолитической альдолазы используют белок FbaA, то есть альдолазу класса II. Однако в геномах некоторых бактерий, включая E.coli, имеется также ген альдолазы класса I, или FbaB. В нормальных условиях роста эта альдолаза является минорной формой. Повышенная экспрессия FbaBнаблюдается в стрессовых условиях: при недостатке питательных веществ или воды в питательной среде, при переходе в стационарную фазу роста и т.п. Этот факт позволяет предположить, что FbaB в этих видах бактерий, помимо основной каталитической функции, выполняет также роль адаптивного белка, помогающего бактерии выживать в стрессовых условиях. В данной работе приведен обзор литературы и предложен проект исследования с целью выяснить, в каких именно видах стресса участвует FbaB, а также выявить другие возможные функции этого фермента в E.coli.

2. ФРУКТОЗО-1,6-БИСФОСФАТАЛЬДОЛАЗА КЛАССА I

КАК БЕЛОК ОТВЕТА НА СТРЕСС В E.COLI

(Обзор литературы)

1. Классификация альдолаз.

Альдолазы – группа ферментов, относящихся к классу лиаз и катализирующих реакции альдольного расщепления. Фруктозо-1,6-бифосфатальдолазы (Fba), в частности, отвечают за разложение фруктозо-1,6-бифосфата (FBP, рис. 1), реакцию первой фазы гликолиза. Обратная реакция, также катализируемая этими ферментами, является одной из стадий глюконеогенеза – синтеза глюкозы из неуглеводных источников.

Рис. 1. Реакция, катализируемая фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазой.

Рис. 2. Схема каталитического действия альдолазы класса I.

Альдолазы как таковые делятся на два принципиально различных и, очевидно, генетически не родственных класса, I (FbaB) и II (FbaA). Ферменты обоих классов катализируют депротонирование гидроксильной группы и последующий разрыв связи C-C. Разница между ними состоит в механизме атаки на субстрат - FBP. В реакции с участием альдолазы класса I формируется основание Шиффа между карбонильной группой FBP и аминогруппой остатка лизина в активном центре фермента (Рис. 2). Сдвиг электронной плотности позволяет соседней OH-группе депротонироваться, что приводит к расщеплению связиС-С. В альдолазах класса II роль электрофильного реагента, поляризующего карбонильную группу, выполняет двухвалентный катион, как правило, Zn²⁺, который содержится в молекуле фермента.

Различие в механизме позволяет дифференциально определять активность альдолаз двух классов, используя селективные ингибиторы. Ингибиторами для альдолаз класса I являются восстановители, превращающие основание Шиффа в устойчивую связь, а для альдолаз класса II – комплексообразователи, связывающие кофакторный ион металла в прочный комплекс [1].

1. Экспрессия FbaB в различных организмах.

Первоначально альдолазы класса I были открыты у растений и животных, позже – у архей. Долгое время считалось, что этот класс ферментов не характерен для эубактерий, которые в качестве основной гликолитической альдолазы синтезируют альдолазы класса II. Однако спустя некоторое время ряд исследований на различных микроорганизмах [2-5] выявил присутствие в их геномах (в дополнение к генам fbaA, кодирующим альдолазы класса II) генов fbaB, кодирующих альдолазы класса I. Для некоторых бактерий (включая Escherichiacoli и Micobacteriumtuberculosis) присутствие альдолазFbaB была показана на уровне экспрессии активного белка. Впоследствии было составлено филогенетическое древо альдолаз класса I [7]. Эти данные показали, что альдолаза класса I – не принадлежность исключительно эукариот, как считалось прежде. Таким образом, фермент класса I либо существовал в живой природе до дивергенции на прокариот и эукариот, либо возник повторно конвергентным путём у эубактерий [2].

Высшие эукариоты экспрессируют исключительно Fbaкласса I. В организме человека присутствуют три тканеспецифичных типа альдолаз: печени, мышц и мозга. Качественные реакции на альдолазу класса I находят практическое применение в медицине. В норме альдолазы существуют в цитоплазме клеток тканей и не секретируются в кровь; наличие альдолазной активности в сыворотке крови свидетельствует о патологиях, сопровождающихся разрушением тканей (в том числе о скрытой травме головного мозга). Кроме гликолитической функции, альдолаза печени является ключевым ферментом метаболизма фруктозы. Генетически обусловленные дефекты в гене этого фермента приводят к мутациям, в результате чего развивается патология, известная как «непереносимость фруктозы». Эта патология потенциально летальна, если ее не распознать на ранних стадиях жизни ребенка. Таким образом, исследование альдолаз имеет и прикладное значение.

Альдолазы класса I из различных царств значительно различаются по аминокислотной последовательности. Степень идентичности между альдолазами класса I упрокариот и эукариот составляет 17-28%, в то время как внутри одного царства она значительно выше (например, между ферментами эукариот – не менее 50%). Антитела к альдолазам млекопитающих также не дают реакции с FbaB из E.coli. Такая же низкая степень идентичности (не выше 26%) наблюдается и при сравнении последовательностей FbaB из эубактерий и архей. Таким образом, в филогенетическом древе альдолаз класса I фермент из E.coli стоит в особой ветви дендрограммы.

Ряд низших эукариот, например, Euglenagracilis, Chlamydomonasmundana, Chlamydomonasrheinhardii, подобно E.coli, синтезируют альдолазы как класса I, так и класса II в различных пропорциях, в зависимости от условий. Синтез ферментов обоих классов позволяет предположить, что помимо основной функции – катализа альдольного расщепления – альдолазы имеют ряд других жизненно важных функций в клетке, различных у классов I и II.

В клетках E.coliальдолаза класса I была впервые обнаружена при изучении ранее известной альдолазы класса II у этого микроорганизма [2]. Отнесение вновь открытого фермента, катализирующего распад FBP, к классу I основывалось на следующих признаках:

1. Активность фермента не ингибировалась даже высокими концентрациями ЭДТА, к которой очень чувствительныальдолазы класса II, содержащие катион металла.

2. Фермент подвергался необратимому ингибированию NaBH₄ в присутствии субстрата (что указывает на существование основания Шиффа в качестве интермедиата).

3. Фермент также был чувствителен к N-этилмалеимиду, что характерно для альдолаз класса I.

Ранние исследования показали, что альдолазаFbaB в E.coli представляет собой октамер (что не характерно для других альдолаз) с молекулярной массой 303,8 кДа. В настоящее время эти сведения откорректированы и показано, что фермент функционирует как декамер с молекулярной массой 380 кДа. Учитывая, что большинство бактериальных альдолаз (FbaА, т.е. класса II), как правило, образуют моно-, ди- или тетрамеры, а для эукариотическихFbaB характерны тетрамеры, следует ожидать, что сложная олигомерная структура у фермента E.coli нужна для выполнения им другой функции, кроме катализа расщепления FBP [2, 6].

Было также установлено, что субъединица бактериальной FbaB может существовать в двух формах: полной (full-length), соответствующей открытой рамке считывания у гена FbaB, и зрелой (mature), укороченной на 24 аминокислотных остатка с N-конца[7]. Каталитические свойства обеих форм в реакции альдольного расщепления одинаковы. Invivo присутствуют одновременно обе формы, что может указывать на функциональное различие двух белков [6].

1. Предполагаемые функции FbaB в бактериальной клетке.

FbaB не постоянно присутствует в значительных количествах в клетке E.coli: её наличие и количество зависят от условий среды, в первую очередь от источника питания бактерий. Так, в культуре, выращенной на глюкозе, FbaB не обнаружена вообще или присутствует в очень малых количествах: ее активность составляет 0-5% от общей фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазной активности [2]. Если же в качестве источника углерода выступает соединение с короткой углеродной цепью (пируват, лактат, ацетат и т. п.), её активность может преобладать над активностью основной альдолазыE.coli. Например, в экстрактах клеток, выращенных на пирувате, около 60% общей альдолазной активности приходится на FbaB. Логичным выводом из этого факта является гипотеза об участии данного фермента в глюконеогенезе [2].

Изучение экспрессии альдолаз двух классов у M.tuberculosis показало, что их соотношение напрямую зависит от кислородного режима роста клеток. При высоком давлении O₂ (в ферментёре с эффективной аэрацией) основной формой является альдолаза класса I, в условиях же меньшего количества кислорода в фильтрате культуры обнаруживается альдолаза класса II [3, 9]. Очевидно, FbaB участвует в каком-либо метаболическом процессе, который активируется в условиях аэробного роста.

Было достоверно показано [8], что активность FbaB в E.coli значительно повышается в случае роста культуры клеток в условиях лимитированного питания (в том числе в стационарной фазе). Экспрессия гена FbaB регулируется Lrp – регуляторным белком, который при недостатке питания запускает экспрессию белков с обширной группы генов, участвующих в адаптации к голоданию. Степень экспрессии FbaB в период голодания клеток в 8,4 раза выше у штамма, содержащего ген Lrp, чем у штамма с нокаутом генаLrp.

Другой вид стресса, в адаптации к которому предположительно участвует FbaB у E.coli, – нехватка воды. Изначально продукт гена FbaB не отождествлялся с какой-либо ферментативной активностью: этот ген был известен как dhnA и кодировал белок дегидрин, играющий ключевую роль в выживании клетки при дефиците воды. Однако впоследствии при секвенировании гена dhnA и анализе аминокислотной последовательности FbaB было установлено их соответствие [7].

Таким образом, ряд исследований позволяет предположить, что альдолазаFbaB в E.coli и, возможно, в других эубактериях играет роль в адаптации к различным видам стресса, т.е. в переходе не нетипичные для нормального роста организмов метаболические процессы [2-6]. Для выявления участия альдолазы в конкретных видах стресса, а также для выявления других возможных функций этого белка необходимы дополнительные эксперименты invivo.