166300 (Приготовление сорбентов и колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии), страница 4

После работы колонку следует подготовить к хранению: ее промывают и заполняют растворителем для хранения (для обращенно-фазных сорбентов — метанолом, для силикагеля — гексаном или гептаном, для ионообменников — метанолом, для других колонок — по рекомендации фирмы-производителя). Промытую колонку герметично закрывают заглушками и помещают в коробку для хранения, сделав запись в паспорте о проведенной работе и растворителе для хранения. Очень бережно следует обращаться с таблицами, прикрепленными к колонке и содержащими все данные о ней. Если таблица отклеивается или по каким-либо причинам портится (смывается растворителем надпись), необходимо сразу же изготовить и установить на колонку дубликат. Если таблицу снимают (например, при установке в термостат), ее надежно хранят, а затем снова устанавливают на колонку. Помните, что колонка без таблицы и паспорта (особенно пролежавшая какое-то время) практически бесполезна, ибо установить ее сорбент невозможно или требует большого труда. Особенно следует предостеречь от спешки при смене колонок, когда, не убрав одну колонку, достают другую для установки, кладут рядом, чем-то отвлекаются и... не могут вспомнить, какую колонку нужно поставить, а какую колонку убрать.

Вопрос о том, нужно ли при хранении герметично закрывать концы колонок, некоторыми фирмами решается положительно, а другими—отрицательно. Первые указывают, что при высыхании сорбента в колонке образуются каналы, нарушается равномерность слоя; это ведет к ухудшению эффективности, двоению пиков, ухудшению симметрии пиков. Вторые, напротив, утверждают полную идентичность колонок до и после высыхания сорбента в случае повторного тестирования. Учитывая, что некоторые сорбенты, например, полимерные при высыхании уменьшаются в объеме и при этом равномерность слоя в колонке нарушается (особенно если такая колонка в процессе транспортировки подвергается тряске и вибрациям), целесообразно герметично закрывать концы колонок. Перейдем теперь к регенерации колонок, под которой понимают восстановление разделительных и эксплуатационных характеристик колонки, потерянных в процессе эксплуатации. Утрата первоначальных характеристик колонки проявляется в заметном увеличении рабочего давления при том же потоке, в ухудшении разделения пиков за счет потери эффективности, появлении хвостов пиков, изменении порядка выхода компонентов, в резком уменьшении или увеличении времени удерживания компонентов и т.д. Как правило, колонка утрачивает свои свойства в процессе эксплуатации в силу следующих причин. Во-первых, это нарушение допустимых параметров работы колонки по потоку и давлению растворителя, возникающее из-за ошибок оператора (неправильная задача расхода, использование высоковязких растворителей и т. п.). При этом, если давление превысит значение, использовавшееся при набивке колонки, сорбент неизбежно уплотнится, просядет, в начале колонки появится пустота (мертвый объем), пики будут размываться и эффективность колонки будет утрачена. Во-вторых, это ошибки оператора, связанные с выбором растворителя, т.е. использование растворителя с рН ниже 3 или выше 8. В этом случае происходит ускоренное разрушение, особенно при повышенных температурах, силикагелевой матрицы с растворением силикагеля, уменьшением его механической прочности, химическим отщеплением привитой фазы. Изменение природы сорбента, естественно, меняет параметры удерживания веществ и приводит к нарушению хроматографического процесса, а также к проседанию сорбента в начале колонки из-за ухудшения его прочности. В-третьих, это загрязнение входного фильтра колонки частицами, попадающими в поток вследствие применения нефильтрованных растворителей, содержащих взвеси проб, а также появляющихся за счет износа уплотнений поршней, клапанов, инжектора. Это приводит к уменьшению числа пор фильтра, росту его гидравлического сопротивления и возрастанию давления на колонке. Необходимо фильтровать растворители и пробы и устанавливать дополнительные фильтры в линии для улавливания частиц, образующихся в процессе работы поршней, клапанов, инжектора. В-четвертых, это химическое загрязнение колонки. Его избежать полностью не удается, так как даже высокочистые растворители для ВЭЖХ, не говоря о технических видах, содержат некоторое количество примесей, продуктов фотохимической я окислительной деструкции растворителей, их стабилизаторов, примесей, тары и др. Пробы также содержат примеси, состав которых часто установлен не полностью. Эти примеси, если они не элюируются в условиях анализа, постепенно накапливаются на сорбенте в начале колонки и, играя роль нанесенной активной фазы, начинают избирательно удерживать некоторые компоненты пробы вплоть до их необратимой сорбции. Если эти примеси элюируются с большим временем удерживания, они приводят к нестабильности положения нулевой линии в виде дрейфа в ту или другую сторону, широких «горбов» в самые неожиданные моменты и т.д. К такому же «химическому» загрязнению, изменяющему параметры удерживания, приводит использование силикагеля, а в качестве подвижной фазы — влажного гексана или гептана, постепенно «загрязняющих» безводный силикагель водой. Регенерацию вышедшей из строя колонки (в отличие от ремонта колонки) проводят без снятия концевых фитингов. Выбирают комплекс растворителей и химикатов, который позволяет удалить нежелательные загрязнения с сорбента и фильтров химическим или физико-химическим воздействием. Регенерация успешна только в том случае, если в процессе эксплуатации колонки не произошло физической или химической деградации слоя сорбента, т. е. образования каналов, пустот или отщепления привитой фазы. Первый вопрос, который возникает при регенерации, — это можно ли для ускорения и улучшения процесса изменить направление потока через колонку, чтобы загрязнения с сорбента и фильтра на входе сразу удалялись, не проходя через весь слой сорбента. Вопрос не праздный, так как некоторые опытные специалисты считают это возможным, а другие решительно отрицают, указывая на возможность нарушения плотности упаковки, образования каналов и т.д. Фирмы-производители также не единодушны: некоторые считают изменение направления потока через колонку опасным; другие, напротив, рекламируют свои колонки как способные работать при любом-направлении потока; третьи даже не указывают для своих колонок направления потока, полагая, что это безразлично.

Слой сорбента в колонке, по нашему мнению, не окончательно сформирован и однороден после упаковки колонки. Если после упаковки и снятия давления верхний слой сорбента в колонке выравнивается и закрывается фитингом при атмосферном давлении, то нижний слой (со стороны детектора) продолжает оставаться под давлением из-за трения слоя сорбента о стенки колонки; если снять нижний фитинг, это давление выдавливает сорбент из колонки (даже жесткий на основе силикагеля, не говоря уже о полужестких на полимерной основе) довольно заметно, в случае силикагеля на 1—1,5 мм. Поэтому изменение направления потока при регенерации колонки нецелесообразно» особенно при повышенных скоростях потока и высоком давлении. Если это все же осуществляется, следует уменьшить расход растворителя и снизить давление так, чтобы они не превышали 1/2 или 1/3 от значений рабочих параметров.

Какими растворителями и в какой последовательности вести регенерацию колонок—это зависит от типа сорбента и от предполагаемых загрязнений, которые следует удалить. Имеется много рекомендаций, какие растворители, в какой последовательности и для каких сорбентов использовать, однако никто лучше хроматографиста не знает, какие загрязнения он «посадил» на колонку и какой растворитель пригоден для их удаления. Если загрязнениями являются соли, то для их удаления лучше всего вода, если полимеры — хлороформ или тетрагидрофуран, если вода — безводные спирты, хлоруглеводороды и т.д. Для трудноудаляемых загрязнений, особенно биологических, используют диметилформамид, диметилсульфоксид, сильные буферные растворы. Не следует забывать о принципе полной смешиваемости последующего и данного растворителей, иначе возможно образование гетерофазных систем. Для регенерации силикагелевых колонок рекомендуется использовать следующий ряд растворителей: тетрагидрофуран, метанол, тетрагидрофуран, метиленхлорид, гексан. Ряд для обращенно-фазных колонок и нитрильных фаз: вода, диметилсуль-фоксид, метанол, хлороформ, метанол. Ряд для аминофаз и сильных анионообменников: вода, метанол, хлороформ, метанол, вода (если аминофазу используют в водных системах растворителей). Ряд для аминофаз (неполярные растворители): хлороформ, метанол, вода, метанол, хлороформ. Ряд для сильных катионитов; вода, тетрагидрофуран, вода. Ряд для органических гелей — сополимеров стирола и дивинилбензола (эксклюзионная хроматография): толуол, тетрагидрофуран, 1%-ный раствор меркаптоуксусной кислоты в толуоле или тетрагидрофуране, тетрагидрофуран, толуол. Приведенные рекомендации могут дополняться и видоизменяться в соответствии с опытом, накапливаемым в процессе работы. Если в результате регенерации не удалось восстановить работоспособность колонки, следует попытаться провести ее ремонт. Ремонт колонки начинают с того, что с нее снимают входную заглушку, осторожно, двумя ключами ослабляют затяжку входного фитинга и снимают его. Если фитинг имеет впрессованный фильтр, а колонка имела высокое давление при работе, вероятным является закупоривание фильтра твердыми частицами. Такой фитинг присоединяют к насосной системе, создающей высокое давление и расход растворителя, и прокачивают через него растворитель в направлении, противоположном рабочему, и при максимально возможном расходе и давлении для удаления частиц-загрязнителей. Затем фитинг помещают в ультразвуковую баню с горячим раствором ПАВ и обрабатывают 5— 10 мин, после чего промывают растворителем и снова прокачивают растворитель при высоком расходе и давлении. Как правило, таким путем удается удалить большую часть загрязнений с фильтра и восстановить работоспособность фитинга. Если фильтр не запрессован, его чистят механически, осторожно счищая частицы с поверхности жесткой щеткой, затем обрабатывают с ПАВ в ультразвуковой бане и снова механически чистят. Наилучшим решением является замена фильтра новым, однако следует соблюдать осторожность и использовать новый фильтр такой же толщины и конструкции. Если толщина нового фильтра меньше, образуется пустота вначале колонки, и пики будут размываться. Подготовив фильтр и фитинг, их и конец колонки очищают от загрязнений (частиц сорбента, ржавчины и др.) механически и растворителями и сушат. На время работ с фитингом конец колонки, чтобы он не высыхал и из него не выпадал сорбент, закрывают пластмассовым колпачком, а колонку зажимают за нижний фитинг в тиски открытым концом вверх. Далее переходят к осмотру верхнего слоя сорбента: в процессе работы может произойти его проседание, чем оно больше, тем труднее отремонтировать колонку и меньше шансов на успех ремонта. Если проседание небольшое, то простейший способ ремонта — заполнение пустоты стеклянными микрошариками размером 40 мкм, засыпаемыми всухую, или же пелликулярным сорбентом с такой же по типу привитой фазой. При этом мертвый объем практически исчезает и разрешение колонки восстанавливается. Если проседание большое, можно либо попробовать заполнить пустоту стеклянными шариками или пелликулярным сорбентом, либо попытаться дозаполнить колонку суспензионным методом. В последнем случае готовят суспензию сорбента в подходящем растворителе и, наливая ее в пустоту, дают сорбенту осесть, затем удаляют растворитель и повторяют операцию до тех пор, пока уровень сорбента не сравняется с верхним краем колонки. Тогда надевают верхний фитинг с фильтром, присоединяют колонку к хроматографу и прокачивают растворитель, постепенно увеличивая его расход и давление до максимально возможных, выдерживая при этих-значениях и затем плавно уменьшая до нуля. Дав потоку остановиться, снимают верхний фитинг и осматривают верх слоя сорбента. Как правило, слой сорбента несколько проседает, но пустота уже значительно меньше. Суспензионное заполнение повторяют до тех пор, пока не будет получен стабильный слой сорбента. После этого колонку тестируют и определяют, восстановлены ли ее свойства.

Иногда, осматривая верхний слой сорбента, обнаруживают, что он загрязнен механическими или химическими примесями, изменился цвет сорбента, появились каналы. В этом случае небольшим шпателем осторожно удаляют верхний слой сорбента до того уровня, где (визуально) сорбент не претерпел изменений; образующуюся пустоту заполняют одним из указанных методов. Колонки также ремонтируют, если произошла механическая поломка: заедание и порча резьбы на колонке, отламывание капилляра с конусом, нарушение формы конуса, отламывание части фитинга и др. Отломанный заклиненный капилляр с конусом иногда удается выбить узким пробойником, предварительно сняв фитинг с колонки, если канал достаточно широкий. Если нужно поставить новый концевой фитинг, следует взять новый фитинг того же типа и той же фирмы. При этом следует измерить глубиномером, одинакова ли их глубина, и в случае разницы компенсировать ее толщиной фильтра. После осторожного обжатия нового фильтра и фитинга колонку присоединяют к хроматографу, и, включив поток растворителя, проверяют герметичность. Если ремонт не дает ожидаемого восстановления разделительных характеристик и эффективности колонки, ее оставляют для проведения менее квалифицированной работы (прикидочный анализ неизвестных образцов, анализ загрязненных проб, микропрепаративная работа и т.д.) или заполняют новым сорбентом суспензионным методом, предварительно удалив отработанный старый сорбент.

Литература

1. Drott E.E.//in Chromatographic Science Series, v. 8, Liquid Chromatography of Polymers and Related Materials, ed. J. Gazes. N. Y., M. Dekker, 1977, p. 41.

2. Krishen A., Tucker R.G./Anal. Chem., 1977, v. 49, No. 4, p. 898.

3. Mori S., Yamakctwa A./J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 3, p. 329— 342.

4. Verzele M., Geeraert E./J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 10, p. 559— 570.

5. Nettleton D. E./J. Liquid Chromatogr, 1981, suppl. No. 2, p. 359—398.

6. Rable F. M./International Lab, 1980, v. 10, No. 8, p. 91—98.

7. Small Bore Liquid Chromatography Columns//ed. R. P. W. Scott. N. Y., J. Wiley, 1984. 294 p.