166300 (Приготовление сорбентов и колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии), страница 3

II Набивку проводят при направлении потока «сверху вниз», используя растворители повышенной вязкости.

1. Взвесить в конической колбе вместимостью 100 мл 4— 4,2 г силикагеля, добавить 50 мл 20%-ного раствора глицерина в метаноле.

2. К колонке присоединить фитинг «к детектору», установить заглушку, присоединить к резервуару колонку и предколонку и закрепить в тисках для подачи растворителя «сверху вниз».

1. Заполнить колонку раствором глицерина в метаноле.

2. Приготовить суспензию, тщательно перемешав силикагель и растворитель и поместив колбу на 5 мин в ультразвуковую ванну.

3. Залить суспензию в резервуар, долить до верха раствором глицерина в метаноле, чтобы не оставалось воздуха, завернуть фитинг резервуара и присоединить к нему капилляр от насоса.

4. Снять заглушку с колонки и сразу подать воду насосом под давлением 70 МПа.

5. Через 4—5 мин (для сорбента с частицами 10 мкм) вся суспензия будет продавлена через колонку. Подачу воды прекратить, дать давлению упасть до атмосферного и отсоединить колонку с предколонкой.

6. Отсоединить предколонку, выравнять сорбент на торце колонки шпателем и присоединить фитинг «к инжектору».

7. Пропустить через колонку 200 мл абсолютного метанола для удаления воды и глицерина.

10. Поставить заглушки на колонку и установить табличку с данными колонки. III Набивку проводят при направлении потока «сверху вниз», используя

растворитель сбалансированной плотности.

1. Взвесить в конической колбе вместимостью 100 мл 4— 4,2 г силикагеля, добавить 50 мл растворителя (60% масс. тетрабромэтана и 40% масс. тетрахлорэтилена).

2. К колонке присоединить фитинг «к детектору», установить заглушку, присоединить предколонку, заполнить колонку и предколонку тем же растворителем, присоединить к резервуару и закрепить в тисках для подачи растворителя «сверху вниз».

3. Приготовить суспензию, тщательно перемешав силикагель и растворитель и поместив колбу на 5 мин в ультразвуковую ванну.

4. Залить суспензию в резервуар, осторожно долить до верха гептаном, не оставляя воздуха.

5. Завернуть фитинг резервуара, присоединить капилляр от насоса, снять заглушку колонки и немедленно подать гептан насосом под давлением 50 МПа.

6. Прекратить подачу растворителя и дать давлению упасть до нуля как только вся суспензия будет продавлена через колонку и появится гептан.

7. Отсоединить колонку с предколонкой, отсоединить предколонку, выравнять слой силикагеля на торце колонки и присоединить фитинг «к инжектору».

8. Пропустить через колонку 200 мл абсолютного метанола.

9. Поставить на колонку заглушки и табличку с ее данными.

Все три метода дают возможность получить колонки с силикагелем, заполненные однородно и обеспечивающие высокую эффективность разделения. С сорбентом зернением 10 мкм удается получить колонки длиной 25 см, имеющие эффективность обычно от 4 до 8 тыс. т. т., имеющих приведенную высоту теоретической тарелки от 3 до 6. При использовании имеющихся в продаже не очень узко сепарированных сорбентов это является хорошим результатом. Если использовать очень узкие фракции силикагеля и хорошо их обеспылить седиментацией, удается получить колонки с эффективностью до 12 тыс. т. т., имеющих приведенную высоту теоретической тарелки, приближающуюся к 2.

Значительно сложнее набивка колонок сорбентами с химически привитыми фазами. Выбор методики заполнения колонок такими сорбентами основывают на использовании данных по набивке фирмы-производителя или применяют оригинальные методики, описанные в литературе.

Последние являются наиболее надежными, но зачастую не содержат подробностей, и поэтому дают неудовлетворительные результаты при попытке их воспроизвести. Так как химия поверхности сорбентов с привитыми фазами, особенно обращенно-фазных, сложна, можно обсуждать метод упаковки только конкретного сорбента. Попытка применить описанный в литературе или использовавшийся исследователем метод упаковки другого сорбента «с той же химически привитой фазой на той же матрице» (например, октадецилхлорсилан, привитый к силикагелю), как правило, приводит к неудаче и только как исключение — дает хороший результат.

Опыт автора подтверждает, что даже для новых партий одного сорбента той же фирмы может потребоваться серьезная корректировка методики заполнения колонок, так как химия их поверхности различается в деталях от партии к партии. Надо также учитывать тот факт, что фирмы, производящие и колонки, и сорбенты, не заинтересованы в разглашении секретов упаковки своих сорбентов. Следует с осторожностью относиться к «чудодейственным» жидкостям для приготовления суспензий обращенно-фазных и некоторых других сорбентов, составы которых не раскрываются фирмами-производителями. Утверждения об «универсальности» этих жидкостей для любого обращенно-фазного сорбента и о получении «гарантированно высокоэффективных» колонок являются не более, чем рекламой. Она нередко весьма далека от реальных результатов, которые удается получить, а воспроизвести их состав в случае успеха (особенно если речь идет о полном составе) довольно затруднительно.

1.3 ЗАПОЛНЕНИЕ КОЛОНОК «СУХИМ» МЕТОДОМ

Заполнение колонок «сухим» способом возможно только старыми поверхностно-пористыми (пелликулярными) сорбентами, имеющими размер частиц 35—60 мкм, а также пористыми сорбентами на основе силикагеля с размером частиц 25—40 мкм и больше. Колонки, заполненные сорбентами первого типа, имеют невысокую эффективность по сравнению с колонками, заполненными современными сорбентами с размером частиц 5—10 мкм, и имеют малую емкость по пробе. Колонки с сорбентами второго типа также имеют невысокую эффективность, но допускают значительно большую нагрузку пробой и применяются для препаративной работы. Из-за действия поверхностных сил не удается эффективно упаковать колонку сухим способом микрочастицами размером 3—20 мкм.

Заполнение колонок сухим способом проводят следующим образом.

1. Колонку тщательно промыть растворителями и высушить, присоединить концевой фитинг «к детектору».

2. К свободному концу колонки присоединять (на резьбе или с помощью резиновой трубки) небольшую воронку.

3. Засыпать сорбент в колонку через воронку небольшими порциями, достаточными для заполнения колонки на 2—4 мм по высоте; колонку при этом держать вертикально.

4. Уплотнить сорбент, осторожно постукивая колонкой по деревянной поверхности, медленно вращая ее и постукивая деревянной палочкой по стенке колонки примерно на уровне слоя сорбента. Постукивать колонкой несколько раз по деревянной поверхности без постукивания по стенке.

5. Добавить следующую порцию и повторять все операции, пока колонка не заполнится доверху.

6. Несколько минут осторожно постукивать заполненной колонкой по деревянной поверхности, не постукивая по стенке.

7. Отсоединить воронку, выровнять слой сорбента и установить фитинг «к инжектору».

Некоторые авторы рекомендуют использовать механическую вибрацию в комбинации с ручным вращением и постукиванием по стенке колонки, другие — комбинировать механическую вибрацию и вращение на специальном стенде.

1.4 ТЕСТИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПРИГОТОВЛЕННЫХ КОЛОНОК

Приготовленные колонки тестируют на модельной смеси веществ и стандартных растворителях с целью оценки их качества.

Для тестирования колонок c силикагелем, привитыми фазами «нитрил» и «диол» рекомендуется растворитель гексан — изопропанол (100:2 по объему), проба —по 0,5% (масс.) о-крезола и фенола в растворителе.

Для тестирования колонок с обращенно-фазными сорбентами (С2, C8 и C18) рекомендуется растворитель метанол—вода или ацетонитрил—вода (70:30 по объему), проба — по 0,5% (масс.) толуола и n-ксилола в метаноле (ацетонитриле). Если компоненты пробы выходят слишком быстро (для обращенно-фазных сорбентов с малым содержанием привитой фазы), растворитель следует заменить на новый с соотношением компонентов 50:50.

Новая колонка, как правило, содержит растворитель набивки, отличающийся от растворителя тестирования по составу. Поэтому новую колонку устанавливают на хроматограф и подают растворитель тестирования со скоростью 1 мл/мин для колонок диаметром 4,6 мм (стандартных, аналитических). Время, в течение которого устанавливается равновесие колонки с новым растворителем, определяется по стабильности нулевой линии детектора и параметров удерживания тест-веществ и обычно колеблется от 1 до 2 ч. После установления равновесия вводят несколько раз тест-смесь и получают тест-хроматограммы.

Рассмотрение тест-хроматограмм начинают с формы полученных пиков. Пики должны быть достаточно симметричными, не иметь «носов» и «хвостов» — это наиболее частый дефект. Недопустимо двоение пиков — свидетельство наличия каналов или пустот в колонке. Коэффициент асимметрии пиков на 1/10 их высоты должен приближаться к 1, и для колонок хорошего качества должен составлять 0,8—1,3. Далее проверяют время удерживания тест-веществ на хроматограммах: постоянство этой величины свидетельствует об установлении равновесия в колонке и возможности расчета эффективности колонки. Расчет эффективности колонки — числа теоретических тарелок и приведенной высоты эквивалентной теоретической тарелки — проводят по известным формулам (см. разд. 1.1). Для имеющихся в продаже сорбентов среднего качества при хорошо подобранной методике набивки колонок удается получить значение ПВЭТТ от 3 до 6, что соответствует ЧТТ для стандартной колонки длиной 25 см от 4 до 8 тыс. (сорбент размером 10 мкм), от 5,5 до 11 тыс. (7,5 мкм) и от 8 до 16 тыс. (5 мкм).

Начинающему хроматографисту не следует огорчаться, если параметры колонки, особенно эффективность и симметрия, получаются значительно хуже. Это почти неизбежно до тех пор, пока не будет приобретен опыт работы.

1.5 ХРАНЕНИЕ, РЕГЕНЕРАЦИЯ И РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии являются тонким инструментом, сердцем хроматографа и требуют бережного обращения. Ошибка оператора прежде всего сказывается на колонке; она может полностью или частично потерять свои качества в результате превышения давления, ввода нефильтрованного растворителя или пробы, неосторожного удара, слишком сильной затяжки резьбы и т.д. Поэтому правильному хранению колонок, их регенерации и ремонту необходимо уделять внимание.

Начнем с хранения колонок. Фирмы, производящие тестированные и не тестированные, а также пустые колонки для ВЭЖХ поставляют их в специальных коробках, имеющих мягкий пенополиуретановый вкладыш с гнездом для колонки или такие же прокладки. Иногда колонку дополнительно помещают в трубку из пластика и фиксируют на концах держателями. Концы колонки герметично закрывают заглушками разного типа, предотвращающими высыхание сорбента. На самой колонке есть спецификация, в которой даны каталожный и порядковый номер колонки, ее размеры, сорбент и его зернение, направление потока растворителя и другие данные. Если колонка тестирована, то в коробке лежит тест-хроматограмма с условиями испытания колонки и его результатами, если не тестирована, то, как правило, инструкция по тестированию.

Хранить колонку желательно в коробке, в которой она получена; в ней же следует хранить всю соответствующую информацию. Желательно перенумеровать все колонки и на каждую завести паспорт, в котором следует отмечать все виды анализов и растворителей, примерную длительность работы, давление при работе и другие сведения. Хранить все коробки с колонками желательно в одном месте, надежно защищенном от ударов, вибрации, нагрева.

Перед началом эксплуатации новой колонки следует, прежде всего, снять и положить в коробку заглушки, так как они для разных колонок разные, и если будут перепутаны — нарушится герметичность при последующем использовании. Коробка должна иметь ту же маркировку, что и сама колонка. Всегда желательно провести ретестирование колонки в тех же условиях, в которых ее тестировали. Это позволяет установить, не потеряла ли колонка эффективность при транспортировке, проверить эффективность вашей хроматографической системы в целом (по сравнению с системой, использованной фирмой-производителем) и получить свою тест-хроматограмму для новой колонки, которая служит эталоном при следующих проверках в процессе эксплуатации колонки.

Если вы переходите на новую систему растворителей, уточните, каким растворителем заполнена колонка — это обычно указывает фирма-изготовитель или отмечено в паспорте колонки. Помните о возможности образования гетерофазной системы при смене растворителя, всегда используйте в сомнительных случаях промежуточные, полностью смешивающиеся растворители, например изопропанол.