Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В. Г. Белинского

Факультет Кафедра

Естественно-географический биохимии

Дипломная работа

Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4

Студент __________________________________________ Юдина Е. И.

подпись

Руководители ___________________________________ Сметанин В. А.

подпись

__________________________________ Дедюхина Э.Г.

подпись

К защите допустить. Протокол № от « _ » 200 г

Зав. кафедрой ______________________________________ Генгин М.Т.

подпись

Пенза, 2007 г

Содержание

Введение ………………………………………………………………………….4

Глава 1. Обзор литературы……………………………………………….…….. 6

1.1. Хелатирующие соединения…………………………………………….….. 6

1.1.1. Свойства, строение и комплексообразование ЭДТА ………….……….6

1.2. Бактериальная деградация ЭДТА ………………………………………….7

1.2.1 Бактерии, разрушающие ЭДТА …………………………………………10

1.2.2. Характеристика штамма LPM-4………………………………………… 12

1.3. Понятие о кометаболизме …………………………………………………14

1.4. Периодическое культивирование …………………………………………20

1.5. Периодическое культивирование с подпиткой ………………………….23

Глава 2. Материалы и методы ………………………………………………….25

2.1. Условия культивирования………………………………………………….25

2.2. Методика приготовления питательных сред …………………………….26

2.3. Методы анализа…………………………………………………….……….28

2.3.1 Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4 …………..29

2.3.2. Вычисление удельной скорости роста штамма LPM-4 ………………..32

Глава 3. Результаты и их обсуждение …………………………………………33

3.1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4 ……………………………………33

3.1.1. Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА …………………….33

3.1.2. Динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4 …………………………………………………………………………….39

3.1.3. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 ……………….42

3.1.4. Показатели роста штамма LPM-4 при кометаболизме ЭДТА и глюкозы…………………………………………………………………………..44

3.2. Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата…………………………………………………………………………46

3.2.1. Исследование ассимиляции ЭДТА штаммом LPM-4 в процессе культивирования с добавлением ЭДТА ………………………………………47

3.2.2. Исследование ЭДТА-индуцированной ассимиляции глюкозы штаммом LPM-4 в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы..50

3.2.3. Исследование способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА ……………..52

Заключение ………………………………………………………………………60

Выводы …………………………………………………………………………..62

Литература ………………………………………………………………………63

Приложение ……………………………………………………………………..66

Введение

Проблема очистки сточных вод, производство которых в России достигает 500 литров в сутки на душу городского населения, является одной из актуальнейших проблем наступившего века. В настоящее время разработаны и развиваются современные технологии очистки сточных вод. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые биологические методы очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях. Существует множество биопрепаратов, используемых для очистки сточных вод. Это консорциумы микроорганизмов, выделенные методом накопительных культур обычно из активного ила аэротенков городских сооружений очистки сточных вод. Они используются для очистки сточных вод местного значения, например в селах, дачных и коттеджных поселках, небольших поселках городского типа, мини-заводах и т.п. Биопрепараты, содержащие ограниченное число видов микроорганизмов, по спектру разлагаемых веществ уступают свежему активному илу. Однако, они содержат быстро растущие штаммы, которые инициируют процессы разложения органических загрязнений. В нестерильном процессе развиваются также микроорганизмы, содержащиеся в отходах, и в микробное сообщество включаются недостающие звенья [1].

Мониторинг окружающей среды показывает, что в ней происходит постоянное накопление ЭДТА. В мире производится примерно 100 000 тонн ЭДТА в год [2-5]. Многочисленные исследования показали, что деградации ЭДТА в очистных сооружениях не происходит, а в природе существует лишь один значимый способ деградации ЭДТА – разложение комплекса Fe (III)EDTA под действием УФ лучей, который происходит лишь на поверхности воды [3]. Накопление ЭДТА в воде приводит к ухудшению качества питьевой воды, так как ЭДТА способствует переходу в растворенное состояние ионов металлов (в том числе тяжелых и токсичных). Большая часть этих комплексов проникает в грунтовые воды и водопроводы, ухудшая качество питьевой воды. Следует обратить внимание на то, что здоровью человека в первую очередь угрожают комплексы ЭДТА с токсичными металлами, а не ЭДТА, как химическое соединение.

До настоящего времени было выделено лишь несколько смешанных культур и всего три чистые культуры ЭДТА-деградирующих бактерий:

Agrobacterium sp. ATCC 55002, грам-отрицательный изолят BNC 1,

грам-отрицательные бактерии DSM 9103 и Pseudomonas sp. LPM-410.

В лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН был выделен новый ЭДТА-разрушающий бактериальный штамм LPM-4 со специфической потребностью в ЭДТА [6]. Данный штамм является уникальным, т.к. способен расти только на средах, содержащих ЭДТА. Отличительной особенностью данного штамма является то, что он способен метаболизировать глюкозу только в присутствии ЭДТА.

И целью настоящей работы было исследование совместного метаболизма ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4.

Соответственно были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4;

2. Изучение способности клеток к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду;

3. Исследование ЭДТА-индуцированной способности клеток ассимилировать глюкозу в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы;

4. Изучение способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.

Глава 1. Обзор литературы

1. Хелатирующие соединения (комплексоны)

Термин “хелат” был предложен Морганом для обозначения циклических структур, которые образуются в результате присоединения катионов к двум или более донорным атомам, принадлежащим одной молекуле комплексообразующего агента. Название “хелат” происходит от греческого слова, которое означает “клешня”, отсюда и еще одно название этих соединений – “клешневидные”. Основным свойством комплексонов является способность образовывать с большинством ионов металлов в водных растворах комплексонаты. Получается это следующим образом: при введении комплексона в раствор, содержащий катион металла, создаются условия для конкуренции между молекулами гидратной оболочки катиона и молекулами внесенного в раствор хелата, происходит это из-за высокой, по сравнению с водой, донорной способности лигандных групп, их стерической доступности, а также соответствующего значения рН раствора. Конкурирующий с водой коплексообразующй агент, удовлетворяющий этим требованиям, при соответствующих условиях способен вытеснить из координационной сферы аквакомплекса воду с образованием нового комплексного соединения (МеY) [7]. Для ЭДТА подобный процесс выглядит следующим образом:

Ме(Н₂О)_х^п+ +Y^4-=MeY^(n-4)+ + xH₂O

1. Свойства, строение и комплексообразование этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)

Этилендиаминтетрауксусная кислота (С₁₀Н₁₆О₈N₂) - четырехосновная аминокарбоксильная кислота. Молекулярный вес 292,35. Белый кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде, образует стойкие растворы. Растворимость ЭДТА минимальна при рН 1,6-1,8, при уменьшении концентрации ионов водорода в растворе она растет и проходит через максимум при [H]=2,5 г-ион/л.

Структурная формула ЭДТА и идеализированная октаэдрическая комплекса металл - ЭДТА приведены на рис. 1.

Анион ЭДТА^4- содержит 10 активных центров, способных осуществлять координацию лиганда ионами металлов: 2 атома азота и 8 атомов кислорода. В твердой фазе в качестве донорных атомов могут выступать все 10 центров. Однако, геометрия лиганда такова, что с одним атомом металла он может образовывать не более 6 связей: 2 с атомами азота и 4 с атомами кислорода разных ацетатных фрагментов ЭДТА. При этом образуется 5 пятичленных металлоциклов: один этилендиаминный (Е-цикл) и четыре глицинатных (Gly- циклы). Центральный Е-цикл и два Gly-цикла лежат приблизительно в одной плоскости, называемой “экваториальной” плоскостью координационного октаэдра. Эти два Gly-цикла обозначаются как G-циклы. Средние плоскости двух других глицинатных циклов располагаются почти перпендикулярно к экваториальной плоскости и обозначаются как R-циклы [7].

1. Бактериальная деградация ЭДТА

ЭДТА характеризуется очень слабой биологической разрушаемостью.

На рисунке 2 приведена предполагаемая схема деградации ЭДТА, которая была изучена у ЭДТА – разрушающего штамма DSM-9103 [4]. Деградация ЭДТА осуществляется монооксигеназной системой. В бактериальных клетках оксигеназные системы выполняют пластическую функцию, окисляя углеродсодержащие вещества, обеспечивают поступление углерода в клетки.

В. Идеализированная октаэдрическая структура комплекса металл-ЭДТА

Физиологическая роль оксигеназ сводится к конкретной задаче увеличения водорастворимости, полярности окисляемой молекулы [8, 9].

ЭДТА-монооксигеназа состоит из двух субъединиц [10]. Субъединица В является оксидоредуктазой, которая переносит восстановительные эквиваленты от NADH₂ на FMN, а субъединица А трансформирует комплекс металл-хелатирующий агент при поглощении молекулярного кислорода, то есть выполняет роль собственно оксигеназы.

В результате двух последовательных отщеплений ацетильных концов образуется N,N¹-EDDA. Метаболизм N,N¹-EDDA до конца не изучен, предполагается, что он выглядит как показано на рис. 3. То есть молекула N,N¹-EDDA теряет еще один ацетильный остаток. О метаболизме EDMA ничего не известно, здесь возможно два варианта: либо отщепляется последняя ацетильная группа и остается этилендиамин, либо происходит разрыв в молекуле этилендиамина с образованием глицина и аминоацетальдегида или аммиака и иминоацетальдегидацетата.

1. Бактерии, разрушающие ЭДТА

ЭДТА характеризуется высокой устойчивостью; микроорганизмы, способные разрушать это соединение, встречаются в природе очень редко. В настоящее время известно лишь четыре штамма ЭДТА-разрушающих бактерий, выделенные в чистую культуру:

1. Штамм, относящийся к роду Agrobacterium, способный разрушать комплекс Fe (III)-ЭДТА [11];

2. Штамм BNC-1, граммотрицательная бактерия, способный деградировать комплексы ЭДТА с Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ [12];

3. Штамм DSM-9103 граммотрицательная бактерия относится к подклассу α-Proteobacteria [4], способный деградировать комплексы Mg²⁺-, Ca²⁺-, Mn²⁺-ЭДТА и частично хелаты с Co, Cu, Zn, Pb.;

4. Штамм LPM-410 идентифицирован как Pseudomonas sp. [13].

Характеристика штамма LPM-4

Штамм LPM-4 был выделен в лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН к.б.н. Чистяковой Т. И. из активного ила Пущинских очистных сооружений методом накопительной культуры [6]. Клетки неподвижны, колонии на твердой питательной среде с ЭДТА через неделю роста 0,1-0,3 см в диаметре, круглые, перламутровые с синеватым блеском. Аэроб, не обладающий запахом.

Клетки штамма имеют палочковидную форму (0,1-0,2×0,5-0,6 мкм). На среде с ЭДТА клетки могут быть одиночными или парными. Это типичная граммотрицательная бактерия (рис. 4), о чем говорит достаточно толстая клеточная стенка с волнистыми краями. Клетка содержит электронно-плотные включения (при потреблении ЭДТА), которые, как показали исследования на других штаммах, содержат Ca²⁺, Mg²⁺ и PO₄^3- [4].

Штамм LPM-4 уникален по потребностям в питательных веществах. Установлено, что штамм способен расти только на средах, содержащих ЭДТА, и не растет на средах, содержащих глюкозу, этанол, органические кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии и неорганические (сульфат аммония, нитрат калия) или органические (мочевина, пептон, гидролизат казеина, аминопептид, дрожжевой экстракт) источники азота [6].

Данный штамм обладает положительной реакцией на наличие оксидазы и каталазы. Температурный оптимум для роста штамма 32-34˚С. Оптимум рН=7. На жидкой питательной среде с ЭДТА идет защелачивание среды в процессе роста клеток.

Клетки штамма способны разрушать различные комплексы ЭДТА с металлами. Суспензия отмытых клеток штамма разрушала ЭДТА и комплексы Ba²⁺-, Mg²⁺-, Ca²⁺-, Mn²⁺-ЭДТА с постоянной скоростью в диапозоне от 0,310 до 486 ммоль ЭДТА/(г·ч), удельная скорость разрушения Zn-ЭДТА достигала наибольшего значения (0,137 ммоль ЭДТА/(г·ч)) в течение первых 10 часов инкубации, а затем снижалась [6].

Установлено, что штамм LPM-4 способен совместно метаболизировать ЭДТА и глюкозу. Этот процесс можно назвать кометаболизмом.

1. Понятие о кометаболизме

Кометаболизм – это особый случай утилизации смешанных субстратов. Кометаболизм впервые наблюдал Фостер [14] в 1962 году у бактерий, утилизирующих углеводороды. Эти бактерии могут расти на метане, как на единственном источнике углерода, то есть они являются метанотрофами. Однако, они не могут утилизировать такие алканы, как этан или пропан, в качестве единственного источника углерода. Когда бактерии росли на смеси метана, этана и пропана, клетки использовали метан, а также этан и пропан, которые окислялись до продуктов, таких как ацетальдегид, уксусная кислота, пропионовая кислота и ацетон соответственно.

Фостер предложил термин соокисление для описания подобного типа трансформации субстратов. Позднее другие исследователи наблюдали подобное явление с другими типами микробной трансформации; они включают не только окисление, но также и гидролиз, дегалогенирование и так далее, то есть термин “кометаболизм” было предложено использовать в более широком смысле.

В 1982 году Дальтон и Стирлинг предложили следующее определение кометаболизма. Кометаболизм – трансформация неростового субстрата в присутствии ростового субстрата или иного метаболизируемого соединения. Под неростовыми субстратами понимают такие, которые не обеспечивают деление клеток. Ростовой субстрат выполняет несколько функций. Во-первых, поставляет энергию для бактериального роста и процессов поддержания метаболизма нерастущих клеток. Во-вторых, поставляет восстановительные эквиваленты, которые позволяют деградировать неростовые субстраты. В-третьих, ростовые субстраты индуцируют синтез катаболических ферментов, которые обнаруживают загрязняющие соединения (поллютанты) и катализируют их трансформацию. Метаболизм неростовых субстратов не поставляет никакой энергии или восстановительных эквивалентов для микроорганизмов.