94748 (Вплив імплантації синтетичного макропористого гідрогелю та трансплантації клітин нюхової цибулини на процеси регенерації спинного мозку після його травматичного пошкодження в експерименті)

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ

імені академіка А.П. РОМОДАНОВА АМН УКРАЇНИ»

МЕДВЕДЄВ ВОЛОДИМИР ВІКТОРОВИЧ

УДК 617.832-001-089.843-003.93:

616-74:[615.46+611.813-018.1]:57.08

ВПЛИВ ІМПЛАНТАЦІЇ СИНТЕТИЧНОГО МАКРОПОРИСТОГО ГІДРОГЕЛЮ ТА ТРАНСПЛАНТАЦІЇ КЛІТИН НЮХОВОЇ ЦИБУЛИНИ НА ПРОЦЕСИ РЕГЕНЕРАЦІЇ СПИННОГО МОЗКУ ПІСЛЯ ЙОГО ТРАВМАТИЧНОГО ПОШКОДЖЕННЯ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

14.01.05 – нейрохірургія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент АМН України

Цимбалюк Віталій Іванович,

Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, завідувач кафедри нейрохірургії;

Державна установа «Інститут нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України», заступник директора з наукової роботи, керівник відділу відновної нейрохірургії

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Сташкевич Анатолій Трохимович,

Державна установа «Інститут травматології та ортопедії АМН України», завідувач відділу хірургії хребта зі спінальним (нейрохірургічним) центром

доктор медичних наук

Хижняк Михайло Віталійович,

Державна установа «Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України», завідувач відділення лазерної та ендоскопічної спінальної нейрохірургії

Захист відбудеться « 1 » липня 2008 р. о 12⁰⁰ годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.557.01 у Державній установі «Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України» за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мануїльского, 32.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України» (04050, м. Київ, вул. Мануїльского, 32).

Автореферат розіслано « 30 » травня 2008 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради Д 26.557.01,

к.мед.н., ст.н.с. С.Г. Дунаєвська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На даний час у світі проживає близько 2,5 млн хворих, що перенесли спинномозкову травму, і щорічно реєструється 130 тис нових випадків (S. Thuret та співавт., 2006). Контингент спінальних хворих на 75% складається з чоловіків працездатного віку. Близько 80% хворих, що перенесли тяжку хребетно-спинномозкову травму залишаються прикутими до інвалідного візка і потребують спеціалізованого догляду протягом усього наступного періоду життя (В.И. Сипитый, 2001). Зважаючи на це відновлення функції спинного мозку після його травматичного ушкодження набуває важливого значення не лише як медична, але і як соціальна проблема.

Відновлення функції спинного мозку пов’язане із компенсаторною трансформацією структури рухової системи, регенерацією аксонів провідних шляхів, а також із відтворенням нейрональних популяцій на рівні ушкодження. Згідно з сучасними уявленнями ефективність відновного лікування наслідків травми спинного мозку тісно пов’язана з відтворенням сукупності морфофункціональних зв’язків між елементами тканини у ділянці ушкодження та за її межами за допомогою різноманітних варіантів клітинної та тканинної трансплантації. Серед останніх найбільш перспективними вважається використання трансплантації клітинних суспензій різного походження та складу, а також імплантації штучних полімерних носіїв у ділянку травми.

Суміш клітин різних типів та різного рівня диференціювання з наявністю особливо важливих для відновлення провідникового апарату спинного мозку нюхових огортаючих гліоцитів (НОГ) можна отримати при культивуванні тканини нюхової цибулини (НЦ) (S. Pagano та співавт., 2000). Позитивний ефект трансплантації НОГ в зону ураження спинного мозку виявляли на ранніх термінах після моделювання його повного перетину (A. Ramon-Cueto та співавт., 1998) та перетину дорзальних стовпів (M.I. Chuah та співавт., 2004) у нижньогрудному відділі спинного мозку, а також у віддаленому періоді спінальної травми (N. Keyvan-Fouladi та співавт., 2003). Водночас, відсутність позитивного впливу НОГ на регенераційний ріст аксонів відмічали на моделях DREZ-томії (L.M. Ramer та співавт., 2004) та забиття спинного мозку (J.E. Collazos-Castro та співавт., 2005). У деяких роботах було продемонстровано, що трансплантація олігодендроцитів у проміжному періоді спінальної травми на моделі забиття у нижньогрудному відділі спинного мозку на відміну від трансплантації НОГ супроводжується слабопозитивним ефектом (T. Takami та співавт., 2002).

При цьому слід зауважити, що трансплантація клітинних суспензій в зону ушкодження не може слугувати методом вибору у випадку травми, що супроводжується діастазом тканини спинного мозку по всій ширині чи в окремій частині його поперечного перерізу. Тому вивчення ефективності трансплантації полімерного матеріалу – в ділянку дефекту, та клітин НЦ – у прилягаючі зони збереженої тканини спинного мозку є актуальним питанням в контексті розробки клінічно прийнятних методів відновного лікування наслідків травматичного пошкодження спинного мозку.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах комплексної науково-дослідної теми „Розробити засоби відновлення провідності спинного мозку за допомогою імплантації полімерних матеріалів та клітин нюхової цибулини” (номер державної реєстрації 0107U001192), котра виконується на базовій установі кафедри нейрохірургії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця ДУ „Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України” протягом 2007–2009 рр.

Мета дослідження: вивчення впливу імплантації синтетичного макропористого гідрогелю та трансплантації клітин нюхової цибулини (ТКНЦ) на процеси регенерації спинного мозку після його травматичного пошкодження в експерименті.

Завдання дослідження:

• вдосконалити модель однобічного половинного перетину (ОПП) спинного мозку для вивчення впливу імплантації гідрогелю на відновні процеси, що мають місце при цьому варіанті травматичного пошкодження;

• вивчити вплив імплантації гідрогелю в зону травматичного пошкодження спинного мозку на динаміку стану моторної сфери експериментальних тварин;

• визначити особливості патоморфологічних змін у тканині спинного мозку, що виникають у випадку його однобічного половинного перетину та після імплантації гідрогелю в зону травматичного пошкодження;

• вивчити особливості динаміки електрофізіологічних характеристик нервово-м’язового апарату задніх кінцівок у випадку моделювання ізольованої травми спинного мозку запропонованим методом та після імплантації гідрогелю в зону пошкодження;

• вивчити особливості впливу ТКНЦ на динаміку функціональної активності задніх кінцівок та електрофізіологічні характеристики нервово-м’язового апарату у випадку моделювання ізольованої травми спинного мозку вказаним методом, а також після імплантації гідрогелю в зону ОПП.

Об’єкт дослідження: тяжкі травматичні ушкодження спинного мозку.

Предмет дослідження: вплив імплантації гідрогелю та трансплантації клітин нюхової цибулини на процеси регенерації спинного мозку після моделювання його однобічного половинного перетину.

Методи дослідження. Експериментальний: моделювання тяжкого травматичного пошкодження спинного мозку, шляхом його лівобічного половинного перетину (ЛПП) у нижньогрудному відділі, з послідуючою негайною імплантацією гідрогелю в зону травми та проведенням ТКНЦ у віддаленому періоді травматичного процесу; спостереження за динамікою неврологічних порушень у експериментальних тварин; отримання та тривале культивування клітин НЦ зрілих щурів. Морфологічний: проведення світлової та електронної мікроскопії з метою порівняльного вивчення перебігу травматичного процесу за умови імплантації гідрогелю та ТКНЦ. Електрофізіологічний: здійснення кількісної оцінки електричної активності та функції проведення збудження в межах нервово-м’язового апарату шляхом комп’ютерної електронейроміографії. Статистичний: опрацювання на персональному комп’ютері первинних даних, отриманих при вивченні функціональної активності задніх кінцівок та під час електрофізіологічного дослідження і встановлення достовірності відмінностей отриманих для різних експериментальних груп результатів.

Наукова новизна одержаних результатів:

• вдосконалено модель ОПП спинного мозку і вперше використано її для вивчення ефективності імплантації досліджуваного варіанту гідрогелю;

• запропоновано та вперше використано метод аналізу динаміки стану моторної сфери тварин на основі обрахунку показника швидкості зміни функції задніх кінцівок, що поглибило уявлення про фазність перебігу відновного процесу при даному варіанті травматичного пошкодження спинного мозку;

• поглиблено уявлення про особливості впливу імплантації гідрогелю на процеси організації у спинному мозку після його травматичного пошкодження;

• встановлено особливості динаміки електрофізіологічних характеристик нервово-м’язового апарату у випадку ізольованого моделювання травми та після імплантації гідрогелю на часовому інтервалі 1–32 тиж;

• вивчено особливості впливу ТКНЦ на динаміку показника функції задніх кінцівок;

• вперше виявлено особливості впливу ТКНЦ на електрофізіологічні характеристики нервово-м’язового апарату у випадку моделювання ізольованої травми та після імплантації гідрогелю;

• запропоновано патофізіологічний механізм, що пояснює особливості впливу імплантації гідрогелю та ТКНЦ на процеси компенсації втрачених функцій після травматичного ушкодження спинного мозку;

• на основі отриманих даних запропоновано патогенетичне обґрунтування можливості клінічного використання методу імплантації гідрогелю та ТКНЦ з метою відновного лікування наслідків травматичного пошкодженнях спинного мозку.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані поглиблюють знання про перебіг посттравматичного регенераційного процесу у спинному мозку. Позитивний ефект імплантації гідрогелю та ТКНЦ, отриманий на моделі травматичного пошкодження спинного мозку, виявляє доцільність використання цих методів при розробці нових клінічних варіантів відновного лікування наслідків спінальної травми.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є власним науковим дослідженням автора. Сумісно з науковим керівником, проф., д.мед.н. В.І. Цимбалюком визначені мета та завдання роботи, обговорено результати дослідження та сформулювано висновки. Автором самостійно проведено аналіз вітчизняної та закордонної літератури, а також аналіз патентної ситуації стосовно теми дослідження, вдосконалено модель травматичного пошкодження спинного мозку, розроблено протокол проведення імплантації гідрогелю та ТКНЦ, виконано експериментальні дослідження, проведено облік, обробку та інтерпретацію даних моніторингу функції задніх кінцівок, проаналізовано результати дослідження. Сумісно із д.мед.н. В.М. Семеновою проведено дослідження культуральних властивостей клітин НЦ, а також культивування клітин НЦ у присутності промітотичних факторів росту і передтрансплантаційну підготовку суспензійних культур. Сумісно з проф., д.мед.н. Л.Л. Чеботарьовою та Л.М. Сулій проведено електрофізіологічне дослідження стану нервово-м’язового апарату. Сумісно з д.мед.н. В.М. Семеновою проведено світлооптичне патоморфологічне дослідження тканини спинного мозку тварин різних експериментальних груп та здійснено аналіз отриманих даних. Сумісно з проф., д.мед.н. А.Т. Носовим та В.В. Васлович проведено електронно-мікроскопічне дослідження тканини спинного мозку тварин різних експериментальних груп і здійснено аналіз отриманих даних. Сумісно з А.П. Черкасом проведено статистичну обробку первинних цифрових даних.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на ІІІ-му з’їзді трансплантологів України (Донецьк, 2004), Всеросійській науково-практичній конференції „Поленовские чтения” (Санкт-Петербург, Росія, 2007), 61-ій Міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих вчених „Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2007).

Апробація дисертаційної роботи відбулася на засіданні кафедри нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України (протокол №8 від 5 грудня 2007 р.), а також на спільному засіданні Вченої ради Державної установи «Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України» та кафедр нейрохірургії Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л Шупика МОЗ України та Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (протокол №1 від 4 січня 2008 р.).

Публікації. Результати дисертаційного дослідження висвітлені у 6 друкованих наукових працях: 3 статтях у фахових виданнях, включених до переліку ВАК України, та 3 тезах доповідей, представлених на національних та міжнародних з’їздах і науково-практичних конференціях.

Структура та об’єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, 4 розділів, підсумку, висновків, додатків та списку використаних джерел. Робота викладена на 290 сторінках друкованого тексту, проілюстрована 159 рисунками. Список використаних джерел включає 254 найменувань, з них 21 — кирилицею та 233 — латиницею. Робота доповнена 4 додатками, у яких наведені результати статистичної обробки первинних цифрових даних, викладені у 65 таблицях.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи. Отримання, культивування та морфологічне дослідження клітин НЦ щура здійснювали згідно з загальноприйнятими протоколами культивування нервової тканини (В.П. Божкова та співавт., 1988). Для збагачення культур проліферативно активними клітинами нейрогенного типу отриману суспензію культивували в живильному середовищі DMEM (Dulbecco’s modіfіed Eagle’s medіum, Sigma) стандартного складу, що включало фетальну телячу сироватку (40%), глюкозу (800 мг/%), інсулін (0,2 ОД/мл), з наявністю рекомбінантного епідермального фактору росту людини (hEGF, експресований E. colі; Sіgma) у концентрації 40 нг/мл і рекомбінантного фактору росту фібробластів людини (hFGF, експресований E. colі; Sіgma) у концентрації 20 нг/мл.