90942 (Выделение и очистка белков сухожилий)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им В.Г. БЕЛИНСКОГО

КАФЕДРА БИОХИМИИ

КУРСОВАЯ РАБОТА:

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВ СУХОЖИЛИЙ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Выполнил: студент группы БХ – 31

Бегутов М.М.

Проверил: проф. Генгин М.Т.

ПЕНЗА

2009

Содержание

Введение

1. Сухожилия, соединительная ткань и коллагеновые волокна

1. Молекулярная структура и типы коллагена

2. Растворимые фракции и агрегация коллагена в фибриллы

3. Данные ЯМР о структуре связанной воды в коллагене с помощью сканирующей калориметрии

2. Способы иммобилизации коллагена из различных органов и тканей. Возможность применения в иммобилизации коллагенов сухожилий.

Заключение

Список литературы

Введение

Медицинская хирургия всегда требует новые материалы. В пятидесятых годах прошлого столетья такие материалы появились благодаря интенсивному развитию химии полимеров. Некоторые синтетические материалы, например, нейлон, капрон, лавсан, дакрон, тефлон и другие, начали внедрять в медицинскую практику по причине их кажущихся на первый взгляд положительных качеств, прежде всего доступности, легкости изготовления, прочности, простоты стерилизации, относительной биологической инертности.

Классическое понятие «биологическое лучше искусственного» подвергли сомнению из-за чрезмерного увлечения полимерными материалами.

С накоплением опыта применения синтетических материалов появился обоснованный скептицизм. Более того, сложные проблемы восстановительной хирургии не решались окончательно.

Инертные полимеры в живом организме оставались, к большому сожалению, инородным телом, они меняли свои физические свойства, поддерживали хроническую воспалительную реакцию; длительность функционирования протезов из полимеров приносила вред живому организму, в научной медицинской литературе появились сведения о канцерогенной опасности полимеров. Поэтому стали уделять больше внимания рассасывающимся материалам, которые в процессе регенерации постепенно замещались собственными тканями живого организма.

1. Сухожилия, соединительная ткань и коллагеновые волокна

Сухожилие – образование из соединительной ткани, концевая структура поперечнополосатых мышц, с помощью которой они прикрепляются к костям скелета.

Сухожилие состоит из компактных параллельных пучков коллагеновых волокон, между которыми расположены ряды фиброцитов (тендоцитов). Чаще в формировании сухожилий участвует коллаген типа I, также встречаются волокна коллагена типов III и V. Пучки коллагена удерживаются вместе протеогликанами. Параллельно ходу коллагеновых волокон расположены кровеносные сосуды, имеющие поперечные анастомозы. Благодаря своей структуре сухожилия имеют высокую прочность и низкую растяжимость.

Форма сухожилий различна – от цилиндрической (чаще у длинных мышц) до плоской, пластинчатой (апоневрозы широких мышц).

В соединительной ткани различают: МЕЖКЛЕТОЧНОЕ (ОСНОВНОЕ) ВЕЩЕСТВО, КЛЕТОЧНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ, ВОЛОКНИСТЫЕ СТРУКТУРЫ (коллагеновые волокна). Особенность: межклеточного вещества гораздо больше, чем клеточных элементов.

Фибриллярный белок коллаген составляет примерно треть всех полипептидов в организме животных и человека [M.E. Nimni., 1988]. В сухожилиях содержание коллагена достигает 94, в коже – до 75, в костной ткани – около 50%. Коллаген характеризуется высокой степенью молекулярной упорядоченности и кристалличности.

В тканях подавляющая часть коллагена находится в составе коллагеновых волокон. В образовании их из фибрилл принимают участие протеогликаны и структурные гликопротеины, играющие роль интерфибриллярного цементирующего вещества, поэтому необходимо дифференцировать коллаген как биохимическое понятие (молекулы, полимеризирующиеся в фибриллы) и гетерогенное с химической точки зрения коллагеновое волокно как морфологическое понятие. В биохимической и морфологической литературе о коллагене в одни и те же термины нередко вкладывают различное содержание.

1.1 Молекулярная структура и типы коллагена

Основной структурной единицей коллагена являются стержнеобразные молекулы тропоколлагена, состоящие из трех спирализованных полипептидиых цепей, называемых α-цепями, которые скручены между собой в одну общую спираль и стабилизированы водородными связями. Молекула коллагена имеет относительную молекулярную массу 300 000 дальтон, длину 280 нм и толщину 1,4 нм. Каждая α-цепь содержит в среднем около 1040 аминокислотных остатков. Отличительной особенностью коллагена является присутствие оксипролина и оксилизина (химических маркеров коллагена), отсутствие триптофана, низкое содержание тирозина и метионина, высокое содержание глицина (около трети аминокислот), а также пролина и оксипролина (четверть). Концевые участки а-цепей на N- и С-концах молекулы (телопептиды) имеют отличный от основной части аминокислотный состав. Они не содержат пролина и оксипролина и не имеют глицина в каждой третьей позиции и поэтому не образуют тройной спирали. Было показано [Wess T.J., Hammersley A.P., Wess L., Miller A., 1995], что структура коллагена формируется путем параллельной укладки трипептидных молекул тропоколлагена с продольным сдвигом на ~1/4 их длины. В продольном направлении (ось c структуры коллагена) концевые С- и N‑группировки соседних трехспиральных молекул не соприкасаются, а величина промежутков, или ″щелей″, составляет около 340 Å в длину. Распределение подобных ″вакансий″ поперечным сечением около 15 Å в супрамолекулярной структуре коллагена является строго упорядоченным, что проявляется в форме характерной поперечной исчерченности коллагена с периодом с₀ = 640 Å, видимой на электронно-микроскопических снимках [2–4]. При окрашивании ″плотные″ участки остаются светлыми, тогда как вакансионные, или ″рыхлые″, участки окрашиваются в темный цвет. Таким образом, в направлении оси с в коллагене наблюдается регулярное чередование светлых, или упорядоченных, участков размером 300 Å и темных, или разупорядоченных, (рыхлых) участков размером 340 Å, включающих указанные выше молекулярные вакансии, или ″щели″.

Иммунологические исследования показали наличие в молекуле коллагена трех различных групп антигенных детерминант: 1) терминальных, находящихся в телопептидах, 2) спиральных, локализующихся на поверхности молекул, и 3) центральных, находящихся в а-цепях и освобождающихся при частичной или полной денатурации коллагена, т.е. при распаде трехспиральной спирали на отдельные цепи [Timpl R., 1976].

Важнейшим достижением последних лет является открытие гетерогенности коллагена. Из разных тканей выделены четыре генетически различных типа коллагена. Они различаются комбинацией в трехцепочечной молекуле пяти α-цепей [«1 (1); α2; αl(II), αl(III) и αl(IV)], которые кодируются различными генами и имеют некоторые особенности первичной структуры [Trelstad R.L., 1974; 1977; Epstein E.H. et al., 1975; Gay S., Miller E.J., 1978]. Распределение типов коллагена в тканях приведено в табл. 5, составленной по данным биохимического анализа. Иммунологические отличия коллагена разных типов позволили в последние годы благодаря иммуноморфологическим методам с использованием типоспецифических антител изучить локализацию разных типов коллагена в соединительнотканных структурах (табл. 6).

Как видно из данных табл. 6, наиболее распространенной изоформой является коллаген I типа, состоящий из двух<х1 (I) цепей и одной а2 цепи. Коллаген II типа [три αl (II) цепи] выделен первоначально из хрящевой ткани, но затем обнаружен в стекловидном теле и других тканях глаза. P. Smith и соавт. (1976) показали, что он синтезируется эпителием сетчатки. Тип III [три >al (III) цепи] первоначально был обнаружен в коже эмбрионов и аорте, но затем выяснилось, что он содержится в тех же тканях, что и тип I в различных пропорциях с последним. Больше всего его в аорте и кишечнике, по-видимому, в связи с наличием там гладких мышц, которыми он синтезируется наряду с коллагеном типа I [Layman D.L. et al., 1977], а также в строме внутренних органов, что объясняется наличием ретикулиновых волокон, состоящих из коллагена III типа [Wick G. et al., 1978]. Коллаген IV типа, состоящий из трех al (IV) – цепей, выделен из базальных мембран и капсулы хрусталика [Kefalides N. А., 1975].

В настоящее время обнаружены определенные особенности коллагенов разного типа [Miller A., 1976; Trelstad R.L., 1977; Fessler J.H., Fessler L.J., 1978]. Коллагены III и IV типов отличаются более высокой степенью гидроксилирования пролина, а также содержат цистин, благодаря чему способны образовывать дополнительные дисульфидные связи. Тип II и особенно IV тип содержат значительно больше оксилизина и углеводных остатков, что, возможно, стабилизирует комплекс коллагенов с протогликанами. В коллагене IV типа молекулярная масса а-цепей выше, чем в других типах (120 000–180 000 дальтон), что расценивается как отсутствие отщепления концевых пептидов проколлагена, препятствующее образованию в базальных мембранах фибрилл с типичной периодичностью [Minor R.R. et al., 1975].

Следует указать также, что, помимо макрогетерогенности, существует и микрогетерогенность коллагена, т.е. менее существенные отличия внутри типов в степени гидроксилирования пролина и лизина, содержании различных аминокислот и углеводных остатков [Prockop D. et al., 1976]. Это связано с тканевой специфичностью коллагена. Например, существуют подвиды II типа для гиалинового и фиброзного хряща, I типа для кожи, сухожилия, роговицы, две разновидности IV типа [Bailey А. et al., 1979].

По-видимому, макро- и микрогетерогенность первичной структуры коллагена играет важную биологическую роль, определяя особенности коллагеновых волокон на более высоких структурных уровнях и характер взаимодействия их с другими компонентами соединительной ткани и с клеточными' элементами, что в совокупности определяет функциональные особенности разновидностей соединительной ткани.

1.2 Растворимые фракции и агрегация коллагена в фибриллы

После секреции в межклеточное пространство и отщепления, пропептидов молекулы коллагена агрегируют в фибриллы, являющиеся первичной формой надмолекулярной структуры коллагена. Поскольку молекулярный механизм фибриллообразования в Организме мало доступен для изучения, основные гипотезы получены на основании исследования агрегации молекул при осаждении их из растворов коллагена.

Типы растворимого коллагена можно разделить на две основные категории. К первой категории (нативные растворы) относятся растворимые фракции, получаемые прямой экстракцией из соединительной ткани молодых животных, у которых коллаген еще недостаточно скреплен межмолекулярными связями. Различаются кислоторастворимый и нейтральносолерастворимый коллаген, экстрагируемые соответственно кислыми буферами и нейтральными солевыми растворами. Ко второй категории относятся растворы зрелого, нерастворимого коллагена, полученные после предварительной ферментативной, химической или механической обработки ткани (солюбилизированный коллаген). Эта категория растворов была использована нами для создания лечебных препаратов из коллагена.

В зависимости от условий осаждения (рН, ионная сила, температура и др.) из раствора коллагена можно получить различные типы фибриллярных структур:

1) фибриллы с неупорядоченной структурой без периодичности;

2) кристаллы длиной 280 нм (SLS‑сегменты), представляющие собой параллельную агрегацию молекул бок в бок. В SLS определили 117 поперечных асимметричных полос, которые, подобно «отпечатку пальцев», характеризуют распределение полярных и неполярных аминокислотных остатков;

3) фибриллы FLS с периодом 280 нм, в которых молекулы также агрегируют параллельно, но ориентированы в соседних слоях в разные стороны (опозиционно), так что N‑концы соединены с С-концами; Рис. 27. Возможные пути внутриклеточного транспорта и секреции коллагена.

4) фибриллы нативного типа (т.е. соответствующие тканевым) с периодичностью 64–67 нм. Основной период в этих фибриллах состоит из светлой А-зоны и темной В-зоны, особенно отчетливо видимыми при негативной окраске фосфорно-вольфрамовой кислотой. После позитивного контрастирования в периоде обнаруживается 12 темных и 12 светлых дополнительных полос, отражающих первичную структуру молекулы [Kuhn К., 1974].

Для изучения фибриллогенеза в организме наибольшее значение имеет механизм агрегации молекул в фибриллы нативного типа, объясняющий наличие периодичности. Начиная с 50‑х годов был выдвинут ряд различных гипотез, из которых наибольшее значение имела модель сдвига соседних молекул на четверть своей длины [Schmitt F. О., Gross J., 1955], и модель R.A. Grant и соавт. (1967), по которой периодичность объясняется существованием на молекулах «полос связывания» длиной 26,5 нм, содержащими полярные группы, и полос, содержащих неполярные группы 37,5 нм.