Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002, страница 18

4.15). Вначале в реакционную смесь с очищенной мРНК добавляют короткие ойдо(дТ), обратную трапскриптазу и четыре гНх(ТР (г!АТР, дТТР, г!ОТР, г)СТР). Ро!у(А)-хвост мРНК спаривается с ойко(г!Т), несущим свободную 3'-ОН-группу, которая инициирует синтез комплементарной цепи. Матрипей в этом синтезе служит молекула мРН К, а катализирует его обратная транскриптаза, пролупируемая некоторыми РНК-вирусами. Она последовательно присоединяет к растущей цепи остатки Т, С, О или А, комплементарныс А, Сп С или П мРНК. !п»иго синтез ДНК идет не до конца. при этом обратная транскриптаза перед остановкой обычно «поворачивает вспять» и присоединяет несколько нуклеотидов в обратном направлении (рис, 4.!5), так что в результате образуется «шпилька».

В реакционную смесь добавляют фрагмент Кленова ДНК-полихисразы 1 Е со(й когорый лостраиваст вторук> цепь ДН К, используя первую цепь как матрицу. Он присоединяет дезоксирибопуклеотидгя к растущей цепи, начиная с 3'-ОН-конца шпильки. По окончании синтеза препарат обрабатывают ферментом РН Казой Н, которая разрушает молекулы мРНК, и нуклеазой Ь1, отп!спляющей одноцспочечныс копны Д11К. Полученный препарат представляет собой смесь частично и полностью двухцепочечных комплементарных ДНК-копий (кДНК) мРНК, преобладающей в исходном образпе. Разные кДНК можно встроить в плазмидный вектор и получить кДНК-библиотеку.

Для скрининга кДНК-библиотеки с целью идентификации клонов, несущих специфические гибридные плазмиды, можно использовать метод гибридизации или нммунологическис методы. В последнем случае кДН К должна быть встроена в сайт, находяп!ийся под контролем бактериального промотора, обеспечивающего транскрипцию. Однако практически ни один вектор нс га(рантирует, что во г»строенной кДН К сохранится правильная рамка считывания и синтезируется правильная полипептидная цепь. Тем не менее все положительные клоны, выявленныс тем или иным методом, необходимо подвергнуть дальнейшей проверке и идентифицировать те из них, ко- Технология рскомбинагп ных ДНК 71 мРНК АААААА 3' Палмер ойао(дТ) АААААААААААА 3' 11 ! 1 5' ААААААА ( (1 ! 11 ААААА 111 Т1 Т'1' | Фрагмент Кхкноаа, четыре д)ЧТР | Фрагмент Кленова, четыре г)ЫТР ААААААА ААААА (|Т(! | РНКкэа Н; нуклеаза 5 ! | РНКкза Н: нуклеаза $! Полноразмерная кЛНК Неполноразмернак кЛНК то приходится работать с более крупными фрагментами.

Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага Х Е. сой. После проникновения фага К в клетку Е сей события могут развивнгъся по двум сценариям. Если реализуется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лнзнрует) с высвобождением до!ОО новых фаговых частиц. При ачьтернативном варианте развития событий фаговая торые несут полноразмерную нуклеотидную пос- ледовательность, кодируюшую белок-мишень.

Векторы для клонирования крупных Фрагментов ДНК Векторы на основе бактерао4ага Л С помогцыо плазмиднь|х векторов можно кло- нировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек час- Рае. 4.15. Синтез кДНК. К препарату очищенной м!'НК добавляк!т праймср оййо(ОТ). Для синтеза ДНК на РНК-матрице используют фермент обратную транскриптазу и четыре И(чТР.

1п та!го обрагная транскрнптаза не обеспечивает синтез полноразмерных кДНК-копий на всех матрицах и образует на коппс растущей цепи шпильку со свободной 3'-ОН-группой. Эта группа инициирует синтез второй цепи ДН К при участии фрагмента Кленоаа. После завершения синтеза молекулы мРНК гиаролизуют РНКазой Н, а ДНК обрабатывают нуклеазой а(, а результате чего пол)кгаюгся линейные молекулы ДН К с тупыми концами без шпилек.

72 ГЛАВА 4 ДНК включается в хромосому Е. сой как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами (состояние лизогенни). Олнако при недостатке питательных веществ или иных неблагоприятных обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литический цикл ргзвития. Размер ДНК фага Х составляет примерно 50 т.

п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. и. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицировнгься в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага Х, «вставшего» на литический путь развития. Чтобы понять, как функционирует векторная система на основе фага Х, необходимо рассмотреть молекулярные аспекты литического цикла развития. Инфекционная фаговая частица имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибрилламн). Сборка головки и отростка н упаковка ДНК четко скоординированы. ДН К фага Х вЂ” это линейная двухцепочечная молекула длиной 50 т. п. н.

с одноцепочечными 5 — хвостами» из 12 нуклеотилов. Их назынают липкими (сок) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в Е сей, соз-концы соединяются с образованием кольценой молекулы. На раннем этапе литнческого цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДН К образуется линейная молекула, состояцгая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н. (рис. 4.1б,А). Каждый нз таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица (рнс.

4.16,Б). При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. и. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т. и. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. и. н. в линейной молекуле ДНК разделены соз-сайтами, и именно по этим сайтам раз)тезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку. В результате исследований по изучению сборки фага Х была разработана система упаковки молекул ДНК (п уйго с образованием инфекционных фаговых частиц.

Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы. Один из множества Х-векторов для клонирования имеет два ВатлН1-сайта„фаанкирую1пих участок длиной 20 т. п. н. При гндролизе очищенной фаговой ДНК рестриктазой БатН1 образует- олоякк Линейная молекула ДН К бактернофкта Х 'оковка ок Рне. 4.1б. Лнтнческнй путь развития бактернофага К .4. Прн реплнкапнн кольцевой ДНК бактернофага Х образуется линейная молекула, сосгоящая нз повторяющихся сегментов длиной примерно 50 т.

и. н. Каждый нз этих сегментов представляет собой полноразмерную фатовую ДНК. Б. Фаговая головка вмещает один такой се1 мент, затем к головке присоединяется уже собранный отросток. Технология рекомбинантныхДНК 72 ДНК, фрш мшпы к предполагается кл соз-Байт | ВалзН1; фракционирование по размеру Фрагмент, образуллцнася после расшеплсния Ваагн) (!5-20 т. и. н.) — л~ -20 ззп.н.~— Трансформация клеток Р2-Е гав Бляшки образуются Бляшки ие образ)зсзся Рис. 4Л7. Клонируюшая система на основе бактериофага ).. Фаз оная ДН К имеет два ВгалН1-сай ш, фланкирующих ее 1)Е-сегмент. Клонируемую ДНК расщепляют с помощью ВаглН1, фракционируют полученные фрагменты по размеру и выделяют те из них, ксгпрые имеют размер от 15 до 20 т.

п, н, Фаговую ДНК обрабатгявазот згим же фермегзтом. Оба препарата ДНК смешишнсг и обрабатывают ДНК-лигазой фаш Т4. Лигированная смесь содержит самые разные комбинации ДН К, в том числе 1) воссгановленную ДН К фаш )' и 2) рекомбннаптные молекулы, содержащие К- и ).-области фаговой ДН К и вставку клонируемой ДН К размером -20 т. п.

и., занявшую место области 1/Е фагового генома. Рекомбннантные молекулы упаковывают в шловки бактериофаш ). ш тйш, и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы В инфицированных рекомбинантным фагом клетках Е саВ, в хромосому кошрых интегрирована ДНК бактериофага Р2, могут реплишгроваться и образовывать инфекционные частицы только молекулы ДНК, составленные из К- и ).-областей фаговой ДНК и клонированной вставки размером -.20 т.п.н. 24 ГЛАВА 4 переносят и фиксируют на фильтре вместе с бляшкой. Сопоставив пятна на фильтре, даю!цие положительную реакцию, с бляшками на исходной чашке„отбирают позитивные бляшки и проводят субкчз!ьтивирование.

Субкультуры служат источником рекомбинантных бактсриофагов, которые можно по отдельности культивировать в Е. со!!. Кос миды Рис. 4.!й. Клонирование с помощью космилного вектора. Космила имеет ~очку начала репликации (опу, обеспечивающую ее существование в Е. сей в виде плазмилы; лва интактпых соз-копца, разделенных уникальным сайтом для 5«а!: ВашН1-сайт вблизи одного из соз-саиюв и ши усзойчивости к тетрациклииу (Те!"). ДНК, которую хотят клонировать, расщеги~яют ресгриктазой ВаглН!! и фракциопируюг по размеру, чтобы выделить молекулы длиной примерно 40 т.

п. и. Плазмилную ДНК расщепляют с помощью 5са! и Ваш!П. Оба препарата ДНК смешивают и обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4. Некоторые из гибридных молекул, образовавшихся после лигирования, содержат вставку размером около 40 т. и. и., так что их суммарная длина составляет примерно 50 з. и. в. Эти молекулы упаковываются !и «!!го в ~еловки бакгериофага Х, затем к головкам прикрепляются отростки, и образуюзся инфекционные частицы. При инфицировании этим «фагомх Е.