Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002, страница 14

Белок перед электроФорезом часто обрабатывают анионным детсргснтом лодецилсульфазом натрия (ДСН), что позволяет проводить Фракционированис в зависимости только от одного параметра — молекулярной массы, а зависимость от конформации, плоиюстн упаковки полипептидной цепи и др. исключасгся. Эясктрофорез в ПААГ-ДСН позволяет разделять белки с мсьь массой ог 20 по 200 «Да Для электрофорезичсского разлеления нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные ~ели. Агароза— это особо чистая Фракция, получаемая из агара нли нспосредсп1снно из агаросбразую1пих морских водорослей.

В (,0% а1 арозном геле можно разделять молекулы ДНК размером ог 600 до 20 000 и. и. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар основании), денатурированной ДНК н РНК прихолится использовать специальные системы элсктрофорсза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК примснякп полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним щклеотид<1м. А «соя! есок! + Наин! ВагвН! 650 300 250 Рис.

4.4. Карп~рованис сайтов рестрикции. А. Рсзулюаты гель-злекзрофореза фрагментов ДНК, гюлучениых ее расщеплением указанными ферментами. Очищенную ДНК 1идролизовали рестриктазами Есой! и ВатН ! Раздельно, а затем их смесью, проводили гель-злехзрофорез и визуализировали продукты охрювиванием бромистым зтидисм.

Числа слева от горизонтальных полос— ллипа фрагментов в парах оснований. Б. Рестрикционная карта, построенная по электрофоретическим данным. Числа — расспвшие между сайтами узнавания соответствующих ферментов. должен содержать один из концов исходной молекулы ДНК. Далее, мы видим, что ВатН1 расщепляет ЕсоИ-фрагмент длиной 500 п. н. на два фрагмента размером П)0 и 400 п. и.

и что один из ЕсоИ-сайтов отделен от ВаглН1-сайда 400 п. н.; значит, фрагмент длиной 100 п. и. должен содержать другой конец исходной молекулы. Карта на рис. 4.4,Б иллюстрирует четкое соответствие между положением сайтов рестрикции и размерами фрагментов, получающихся при каждом гидро- лизе. Расщепление рестрицирующими эндонуклеазами имеет еще одно применение. Когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплемептарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов могуг образовываться новые комбинации генов— рекомбинантные ДН К (рис.

4.5). Технология рекомбинантныхДНК 55 Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первых, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необхолим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы, т. е.

для восстановления связи между 3 -гидроксильной концевой группой одной цепи н 5 -фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфодиэфирных связей между концами полинукчеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариваник! липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 «сшиваетэ тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментол! (рис.

4.6). Во-вторых, объеЛи- 56 ГЛАВА 4 Саят узнавания для Ииглн! — С Т АТ1ССАТС С 1ТАССС— — САТАССТАСС1АТССС— $ Саят узнавания лзя даьчн! — АТСТТ1ССАТСС1ТТСАС— — Т А САА1~~ С Т АСОААС ТС— ' Т Расщепление Р САТО С ТАССС— САТССС— ОН ОН вЂ” АТСТТС САТСС ТТСАС— — ТАСААССТАС, СААСТС— ОН ~ОН вЂ” СТАТС вЂ” САТАСС ТАС "Р нне н агжяг Однопепочеч ни й разрыв ОН Р вЂ” С ТАТССАТСС ТТСАС— — САТАсс ТАСС ААСТС— / ~ Р ОН Одноцепочечный разрыв Одноцспоче'шый разрыв ОН Р вЂ” АТСТТССАТСС ТТСАС— — Т АСАА С С ТАСС ААС ТС— / ~ Р ОН Одноцепочечный разрыв Рвс. 4 5.

Отжиг комнлементарныхлипких концов фрагментов, образующихся цри расиеплснин двух разных образцов Днк ресгрицнру!ощеи энлонуклеазой !тавн!. четыре фрапиенпи представленных на рисунке, могут соединпгься друг с другом с образованием шести разных молекул ДНК (на рисунке показаны не все возможные комбинации). Фрагменты удерживакпся вместе водородными связями, образующимися между четырьмя основаниями липких концов, но эти связи недостаточно прочны, побы молекулы в растворе оставались стабильными длительное время. вания с векторной ДНК образуется множество различных комбинаций.

Необходимо уметь распознавать те реципиегпные клетки, которые содержат ДНК с нужной нуклеотидной послеловательностью. Для этого используют различные спет~мы скринипга. пение разных молекул ДНК само по себе бесполезно, если вновь образованные комбинации (рекомбинантные ДНК) не будут реплицнроваться в клетке-хозяине. Таким образом, если одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК.

Чтобы решить эту проблему, используют клопируюшие векторы. В- третьих, при рестрикции ДНК образуется смесь разнообразных фрагзиентов, и после нх лигиро- Плвзмидиые векторы Плазмиды — это внехромосомные автономно реплицируюшиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у А Одиоцепочечныа разрыв ОН Р / — АТОТТОСАТСС ТТСАС— — ТАСААССТАСОААСТО— / Р ОН Одиоцсоочечвыа разрыв ДН К-явгазя Т4 О О Р Фосфолиэфирвяя / х связь О О / — А ТОП ССАТСС ТТСАС— — Т АСАА С СТРЕСС ААС ТО— / О О ~ / Р / ~Ъ О О всех бактерий.

Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из ~а~ой клетки в друтую (Г-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (К- гпазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации).

Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ. аурпс — скрытый, латентный), Размеры плазмнд варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала ренликации (ой>, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна. Некоторые плазмиды представлены в клетке !Π— 100 кошгими; они называются высококоцийнымн. Низкокопийные плазмиды присутствуют в клетке в числе 1 — 4 копий. На долю плазмидной ДНК обычно приходится 0,1 — 5,0% суммарной клеточной ДНК. Если две или более плазмиды не могут сосугцествовать в одной и той же клетке, то говорят, что они принадлежат к одной группе несовместимости.

Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий. У некото- рых микроорганизмов в одной клетке было обнаружено до 8--10 разных плазмил, при этом каждая из них выполняла свои функции, была представлена характерным дли нее числом копий и относилась к своей собственной группе несовместимости. Одни цлазмиды несут специфичный сайт инициации репликации и могут рснлицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактсриальных клетках.

Соответственно различают плазмиды с узким и с широким спектром хозяев. Как автономно реплицирующиеся генетические элементы нлазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клопируемой Д1-!К. Но довольно часто природные (немодифицнрованные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных дли «высококачественногоя вектора свойств. К таким важным свойствам относятся: 1) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. сод значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который люжет быть осуществлена вставка; 3) наличие одного или более селективных генетиче- Рис. 4.6.

ДНК-лигаза Т4 образует фосфодиэфирные связи между 5 чфосфатными и 3'-гидроксильными группами в месте разрыва в остове двухцспочечной ДНК. А. Лигирование липких концов. Б. Лигирование тупых концов. Технология рекомбинантныхДНК 57 Б ОН Р ! — ТОТАССТАС СТАОАТТА— — АСАТОСАТС СА ТСТААТ— ! ! Р ОН О О ~ // р Фосфодиэфирияя / х связь О О / — Т СТАС О Т АСС Т АОА Т ТА— — АСАТСС АТОСА ТСТААТ— О О ~/ Р /Ъ О О 58 ГЛАВА 4 тм Начало реьлихааия скнх маркеров л.ш идентификации реципиент- ных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Поэтому плазмнлные векторы прихолится соз- лавать с помощью генной инженерии. Плаа видный вектор р В1(322 В 80-е голы плазмнлный вектор рВВ322 был олннм нз самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмилного вектора включает строчную букву р (от англ.

р1ахт)г1) и еще несколько букв, имеющих отношение к описапикэ вектора илн к ногории его создания. Так, буквы ВВ в обозначении плазмилы рВВ322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Ролрнгеса, сконструировавших эту плазмияу, а число 322 — цифровое обозначение, взятое нз нх исследовательских протоколов. Длина плазмнлы рВВ322 — 43б! и. н. Она несет лва гена устойчивости к антибиотикам (рис. 4.7), ампициллину (Ашр') н тетрациклину (Те!'), а также уникальные сайты лля ВатН1, ИлгН11 и ЯаЛ в генеТе(", один РМ-сайт в гене Ашр', олин сайт лля ВсаВ1, находящийся за пределами колирующих последовательностей, и сигнал начала репликации„ обеспечивающий реплнкацию исключительно в РВ сод.

Плазмила реплицируется с образованием большого числа копий, в лругие бактернальные клетки переносится с трудом. Как работает клонирующий вектор рВК3227 Если очищенную кольцевую плазмилу рВК322 Ряе. 4.7. 1енетяческая карта плаэмидного вектора рВВ322. Гены устойчивости к тетрацнхлину (Гец) н ампицнллнну (Ап|р') содержат уникальные сайты узнавания для НаЫШ, .Уал, Наг Н1 н РЯ.