Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002, страница 16

М. Мезелсон и др. (Фа!иге 217: 1 ! 10-11! 4) показали, что способность одного из штаммов Е. соа сдерживать размножение инфи- лигазу, в рсзультатс чего получится колы!сван, ковалентно замкнугая молекула. У всех молскул ДНК, расщепленных одной эндонуклеазой, имеются одинаковые концы из 4 — Ь нуклеотидов, а сайт узнавания состоит из шее~и нуклеотидных пар. Мерц и Дэвис сделали вывод, что «...последовательно используя два фермента— рестриктазу К! и ЛНК-лигазу,— люжно «чшрекомбинировать» любые две молекулы ДНК с К1-сантами и получить гибридную молскулух Это открытие стало ключевым и развитии зехнологии рекомбинантных ДНК, поскольку, по словам этих же ученых, указало «простой п>ть...созданин специфических рекол~бинантных молекул ДНК ш ей!го».

64 ГЛАВА 4 Скрининг с полтои(ьв гибридизации Исследуемая ДИК Денатурапия и Фиксация ня фильтре Меченый зонд Гибридизация Гябрялияояяяшяяся днк Рис. 4Д1. ДНК-гибридизация. Исследуемую ДНК цолвергаехг денатурацтли н фнксирукп на твердой подложке, например на нптропсллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый ДНК-зонд (обычно длиной от 100 ло 1000 и.

н.) тоже денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДН К и проводят ил отжиг. Для удаления негибрндизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и впзуаяизируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается. (Метка на рисунке обозначена цветной звездочкой.) последовательности ДНК. Эгу проблему можно решить, используя другую рестриктазу. Следующий после созлания библиотеки этап— это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода: гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующим радиоавтографическим анализом, иммунологический скрининг и скрннинг по активности белка, кодируемого геном-мишенью. Нужную нуклеотидную последовательность в образце ДНК можно обнаружить с помощью ДНК-зоила, спаривающегося только с искомой последовательностью.

Для этого ДНК сначала переводят в одноцепочечную форму, подвергнув ее тепловой обработке илн воздействию щелочью. й этих условиях водородные связи между основаниями разрываются и цепи расходятся Гсхнология рекомбинантных ДН К 65 Радиоавтография этом энергия радиоактивного распада преобразуется а светоаукл энер~ию, которая и регистрируется рентгеновской пленкой, чувствительной к синей области спектра. Все операции при радиоавтографии необходимо проводить в темноте, чтобы не засветить пленку. Очень важной областьк1 применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации спрепараюмДНК, подвергнутым элсктрофоретическому раздсленикь К сожъ1ению, провести «ибрндизапию в самом геле невозможно, поскольку зо»ш не может в него проникнузь.

По- мому ДН К после алек» рофорсза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновмй фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блотгинг) илн с помощью элкщии. Расположение молекул ДНК на фильтре в точногли соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ЛНК подвергак«т визуализировать радиаавтаграфическнм (дополнение 4.2) или другим методом, зависящим ат природы метки. Если камплемецтарнасть между зондом н ДНК-мишенью отсутствует, та гибридизации не происходит, и мы получаем отрицательный результат. Обычгю размер занда варьирует ат !00 да 1000 п.

и, и более, хотя можно использовать как более крупные заиды, так и зонды меньшего размера. Для гибридизации, т. е. для образования стабильного комплекса, необходима, чтобы на участке длиной 50 нуклсотндав совпадало более 80% из них, на эта зависит ат условий реакции. Меченые ДНК-занды можно получить разными способами. Один из пнх, называемый методам случайных праймерав, основан на применении смеси синтетических алнгануклеатцдав (алнгомерав), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеатндов.

Некоторые из этих алигануклеатндав оказываются комплементарными последовательностям ДНК-мише- (происходит денатурацня). Если теперь медленно снизить температуру, та произойдет нх воссоединение (ренатурацня). Прн этом, если в растворе присутствует аднапепачечный ДНК- зонд, ан тоже будет ренатурнравать е ДН К, специфически спариваясь с камплемептврнымн участками. Б результате образуется гибридная ДН К, т. е. двухцепочсчная молекула, цепи которой принадлежат двум разным ДНК. Процедура ДН К-гибридизации состоит в следующем. ДН К-мнцгень подвергают денатурацин и однацепачечные молекулы необратима «пришивают » к твердой подложке (ннтрацеллюлазному или найланаваму фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре.

Затем фильтр нпкубируют с адпацепачечным ДНК-зондам, меченным раднаизатапам или другой меткой. Если нуклсатидпые последовательности зонда и ДНК-мишенн камплементарны, та происходит нх спаривание (т. е. гибридизация) (рис. 4.! 1). Гибридные молекулы можно Этот метод широко применяется лля локализации радиоактивного материата в клетке, срезе ткани или на пластине геля после электрофореза смеси макромолекул. Для регистрации радиоактивных зон на исследуел«мй образец накладывакзт рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро.

«Засвеченные» участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки. Одним из вариантов радиоавтся рафии является Флюорография. В этом случае в исследуемый образец имнрсгнируют сцинтиллятор и вновь накладывают рентгеновскуго пленку. Метод основан натам„что ннзкоэнсргетические р-частицы, образующиеся при распаде изотопа (например, трития), взаимодействуют с молекулами сцнкгиллятора, при дснатурации и Фиксируют, а затем проводят гибриднзацик1 с радиоактивным ДНК-зондом. Гибридизационнмй сигнал регистрируют радиоавтографичсскими мезодами. Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузсрнблотгин га в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Использующиеся в лизературе термины «Нозерн-блотти»п» и «Вестерн-блоттинг» относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия — в переводе «северный» и «западный»вЂ” нс имеют никакого отношения к сторонам света н были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Вонгпегп — южный).

тем самым они как бы напутствовали Саузсрна на разработку новых методов переноса макромолскурк а также четко обозначили, о переносе какил макромолскул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умекгг не только физики, но и биологи. 66 ГЛАВА 4 у Исходная ДНК Денатураияя Олигенуклеотидные праймеры Отжиг 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5' Оигпез ДИК в присутствия Фрагмеыга Кленова и четырех дХТР 5' атеченыв / ДНК -зонд в ).,' И- .гчх.1я ЛЛ, 3' Рис. 4Дя2. Полученгге меченого ДНК-зонла метолом случайных праймеров. К леназурированной двухцспочечной ДНК, содержагдей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций нз юссти нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гнбридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех бК рр (один из кглорых меченый [*]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи.

После денатурации синтезированной ДН К получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые. вместе составляют практически полноразмернук1 исходную ДНК-матрицу. Технология рекомбинанз них ДН К 67 ии и гибридизуются с ними, если ДН К прелварительно дснатурировать (рис. 4.12). После отжигл олигонуклеотидов с денатурированной ДНК-матрицей в рсаю !ионную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеотида (дезоксирибонуклеозидтри4юсфаты; с(14ТР), один из них — меченый, и фрагмсгп ДНК-полимеразы 1 Е, сей (фрагмент Кленова). Фрагмент Кленова обладает ДНК-цолимсразной и 3'-экзонуклеазпой активностями, но нс 5'-экзонуклеазиой активностью, присущей ДНК-полимсразе 1 Е. со!й которая могла бы расщепить новосинтезировапные молекулы ДНК.

Одиночные цепи ДНК-мишени служат матрипами лля синтеза новых молекул Д Н К, а связан ныс с ними случайным образом олигонуклсотиды — затравками (рис. 4.! 2). При радиоактивном мечении олин из гИЧТР солержит о:--'~Р, так что ззР-меченным оказывается и сам зонд. Радиоактивную метку выявляют с помощью радиоавтографии. В качестве нерадиоизотопной метки часто используют биотин, который присосдинякп к одному из четырех г)!чТР.

Для выявления гибридизовавшегося биотинилированного зонда на филшр наносят конъюглт стрептавидина с соответствующим ферментом (например, щелочной фосфатазой). Стрептавидин образует комплскс с биотином, который обнаруживается бла~ одаря тому, что под действием фермента образуется окрашенное иля люминесцируюшее вещество — продукт превращения нанесенного на филыр субстрагл. Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гстероло(ичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхожлении между нуклсотидными последовательностями зонда и искомой ДН К; это позволяет реш ить проблемы, связан н ыс с заведомым различием между ДНК вЂ” источником зонда и исследуемой ДН К.

Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белково~о продукта искомого гена. Скрининг библиотек геномных ДНК обычно проводят цо следукпцей схеме. После трансформации высевают клетки на чашки с питательной срелой и переносят выросшие колонии на твердую подложку (например, на нитроцеллюлозцый или найлоновый филыр); проводят лизис клеток, затем депротеинизацию и ленатурапию ДНК; фиксируя>тДНК на подложке.

Наносят на фильтр мечсный зонд и проводят отжиг, а зш ем ралиоавтографию. Колонии на исхолной юшке, которые содержат гибридизовавшуюся ДНК, выделяют и культивируют (рис. 4.13). Поскольку большинство библиотек получается в результате частичного гидролиза, положительный гибр~щизационный сигнал может быть получен лля нескольких колоний (клонов). Теперь необходимо определить, какой именно клон (сели таковой имеется) содержит искомый ген целиком.