Флуоресцентные характеристики и вращательная диффузия наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах альбумина человека

Введение
Методы флуоресцентной спектроскопии с применением флуоресцентных наномаркеров (зондов и меток) с каждым годом всё активнее применяются в лабораторных исследованиях и используются в физике, химии, биологии. На основе этих методов можно распознавать молекулы и различные вещества, получать качественные и количественные характеристики, одной из важных составляющих этих методов является получение результатов за минимальные сроки без инвазивного воздействия. В частности, с помощью этих методов исследуется строение сывороточного альбумина человека, как нативных молекул, так и претерпевших химическую модификацию вследствие внешних воздействий. Методы хороши и тем, что позволяют получать точные результаты при небольших количествах биологического объекта. Белки формируют класс биомолекул, которые играют важную роль в процессах метаболизма и служат индикатором соматических изменений. Сывороточный альбумин представляет собой глобулярный белок плазмы крови человека, который синтезируется в печени и составляет около 60 % от всех белков, содержащихся в плазме крови. Уникальная способность молекулы сывороточного альбумина человека связывать обширный круг лигандов определяет одну из основных и наиболее важных функций этого белка – транспорт физиологических метаболитов. Механизм связывания лигандов с молекулой сывороточного альбумина определяется наличием на белке специфических участков – связывающих центров. Выделяют шесть главных связывающих центров сывороточного альбумина человека: центр I и II – для связывания малых органических молекул, центры III и IV – для длинноцепочечных жирных кислот, центр V – для лигандов со свободной SH – группой, центр VI – для связывания ионов металлов. Некоторые реакции связывания обеспечиваются электростатическим взаимодействием, другие – носят ковалентный характер, вызывая химические модификации боковых цепей аминокислотных остатков. Связывание небольших наномаркеров, таких как наномаркеры семейства флуоресцеина, происходит с центром I альбумина. К классическим флуоресцентным наномаркерам семейства флуоресцеина относятся – исходное соединение флуоресцеин и его галоген-производные: 4-йод-производная флуоресцеина – эритрозин, 4-бром-производная флуоресцеина – эозин, 4-хлор-4-йодпроизводная флуоресцеина – бенгальский розовый. Люминесцентные зонды (наномаркеры) чрезвычайно чувствительны даже к незначительным изменениям окружающей их сложной системы, будь то живая клетка или буферный раствор с белком. Задачей флуоресцентной спектроскопии является анализ подобных сигналов, изменений и трансформаций. Для исследования структурно – динамического состояния белковых молекул широко используется флуоресцентные наномаркеры. Наномаркеры семейства флуоресцеина в настоящее время используются для исследования связывающих центов (Центра I) сывороточного альбумина человека, их физико-химических свойств и структурных свойств с целью моделирования с помощью этих наномаркеров связывания с альбумином ряда лекарственных препаратов для анализа их фармакинетики. Поэтому представляет интерес исследовать собственные флуоресцентные характеристики данных наномаркеров семейства флуоресцеина в растворах альбумина человека и изучить вращательную диффузию молекул этих наномаркеров в растворах этого белка, что и являлось целью настоящей дипломной работы
Глава 1. Применение флуоресцентных наномаркеров в исследованиях структуры и свойств белков (литературный обзор)
§1.1. Физические основы флуоресцентной спектроскопии
Флуоресценция – излучательный переход из возбужденного состояния с синглетного уровня S1 в основное состояние S0: S1 → S0 + hνфл. (1.1) Такие переходы квантовомеханически “разрешены”, а типичная величина скоростей испускания для них ~ 108 с -1 . Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания ~ 10-11 – 10-8 сек. Время жизни – это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик, такие как стоксов сдвиг, квантовый выход, энергетический выход, время затухания [1, 2, 3]. Стоксовым сдвигом называется сдвиг испускания относительно поглощения в сторону больших длин волн, то есть наблюдается потеря энергии (это явление впервые наблюдал Стокс). Вследствие того, что практически всегда при поглощении и испускании света осуществляется один и тот же электронный переход, соблюдение правила Стокса требует выполнение следующего соотношения hνвозб – h νлюм > 0. (1.2) Впоследствии Ломмель предложил такую формулировку, которая используется в современной науке: спектр излучения в целом и его максимум всегда сдвинуты по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в сторону длинных волн. Эта зависимость получила название закона Стокса – Ломмеля, который может быть записан в следующем виде: hνmaxлюм < hνmaxпогл. (1.3) Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблюдается для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S1. К тому же обычно происходит переход на возбужденные колебательные уровни состояния S0, что приводит к дополнительной потере колебательной энергии. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть ещё более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирующих соединений.