Кандидатская диссертация: Роль hif1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение…………………………………………………………………………………….5 1.01. Актуальность темы исследования…………………………………………………….5
1.02. Степень разработанности темы исследования……………………………………….6

1.03. Цель работы…...………………………………………………………………………..7

1.04. Методология и методы исследования………………………………………………...8

1.05. Научная новизна………………………………………………………………………..9

1.06. Теоретическая и практическая значимость работы…………………………………..9

1.07. Основные положения, выносимые на защиту………………………………………10

1.08. Апробация результатов………………………………………………………………11

1.09. Личное участие автора в получении результатов…………………………………...16

1.10. Структура и объем диссертации……………………………………………………..16

1.11. Финансовая поддержка и благодарности……………………………………………16

• Обзор литературы…………………………………………………………………………18 2.01. История изучения гипоксии………………………………………………………….18

2.02. Понятие о гипоксии и механизмах ее негативного действия на мозг……………..19

2.03. Молекулярно-клеточные механизмы нейропротекции, индуцируемой умеренной гипобарической гипоксией…………………………………………………………...23 2.04. Гипоксическое/ишемическое посткондиционирование……………………………26

2.04.01. Нейропротективные механизмы, активируемые ишемическим посткондиционированием………………………………………………………………...28 2.04.02. Неинвазивные способы посткондиционирования……………………………...31

2.04.02.01. Гипоксическое посткондиционирование умеренной гипобарической гипоксией…………………………………………………………………………………..32

2.04.02.02. Механизмы нейропротективных эффектов нормобарического гипоксического посткондиционирования……………………………………………….33 2.05. Предполагаемые эффекторы нейропротекции, индуцируемой гипоксическим посткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией………………...35

2.05.01. Гипоксия-индуцируемый фактор (HIF1)………………………………………..35

2.05.02. Цитокин эритропоэтин…………………………………………………………..38

2.05.03. Bcl-2 и регуляция апоптоза, опосредуемого митохондриями…………………40

2.05.04. Нейротропный фактор мозга (BDNF)…………………………………………...42 2.06. Пентозофосфатный путь как ключевой регулятор антиоксидантных функций…..46

3

• Материалы и методы исследования………………………………………………………48 3.01. Материалы…………………………………………………………………………….48

3.02. Модель гипобарической гипоксии………………………………………………….48

3.02.01. Режим тяжелой повреждающей гипоксии……………………………………...49

3.02.02. Режим посткондиционирования умеренной гипобарической гипоксией…….50

3.02.03. Режим трехкратной умеренной гипобарической гипоксии……………………50 3.03. Постановка экспериментов с использованием ингибитора HIF1…………………51
3.04. Гистохимические методы…………………………………………………………….51

3.04.01. Гистологическая обработка ткани и изготовление парафинизированных срезов мозга………………………………………………………………………………………..51 3.04.02. Иммуногистохимический метод детекции белков……………………………..52
3.04.02.01. Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга………………………52

3.04.02.02. Количественная обработка результатов иммуногистохимического окрашивания с использованием системы компьютерного анализа изображений……..54 3.04.03. Детекция апоптотических клеток методом TUNEL……………………………55 3.05. Иммуноблоттинг……………………………………………………………………...56 3.05.01. Пробоподготовка…………………………………………………………………56

3.05.02. Определение концентрации белка по методу Бредфорда……………………...57

3.05.03. Электрофорез белков в ПААГ по методу Лэммли……………………………...57

3.05.04. Электроперенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану…………...58

3.05.05. Иммунодетекция белков на мембране…………………………………………..58 3.06. Выделение и электрофоретический анализ фрагментации ДНК для определения интенсивности процессов клеточной гибели………………………………………...60 3.07. Спектрофотометрический метод определения содержания общего белка………..60
3.08. Определение активности Г6ФДГ…………………………………………………….61

3.09. Определение количества НАДФН…………………………………………………...62

3.10. Экстракция цитозольной фракции из гиппокампа и неокортекса крыс…………...63

3.11. Измерение содержания восстановленных тиоловых групп и общего глутатиона...63 3.11.01. Измерение содержания тиоловых групп………………………………………..64

3.11.02. Определение содержания общего глутатиона………………………………….65 3.12. Измерение количества продуктов перекисного окисления липидов………………66 3.12.01. Анализ диеновых, триеновых конъюгатов и коэффициента Клейна………….66
3.12.02. Измерение количества оснований Шиффа……………………………………...66

3.12.03. Определение количества фосфора общих фосфолипидов……………………..67

3.12.04. Определение количества ТБК-активных продуктов…………………………...67

4

3.13. Количественный анализ транскрипции Г6ФДГ методом ПЦР в реальном времени….68

3.14. Статистическая обработка результатов…………………………………………………69

• Результаты и обсуждение…………………………………………………………………70 4.01. Эффекты тяжелой гипоксии и тяжелой гипоксии в сочетании с посткондиционированием умеренной гипобарической гипоксией на гиппокамп и неокортекс крыс……………………………………………………………………….70 4.01.01. Анализ процессов клеточной гибели……………………………………………70

4.01.01.01. Изучение динамики фрагментации ДНК…………………………………….70

4.01.01.02. Изучение количества TUNEL позитивных клеток………………………….71

4.01.02. Содержание проадаптивных белков Bcl-2 и BDNF…………………………….73

4.01.03. Иммуногистохимический анализ содержания HIF1a и Г6ФДГ……………….78

4.01.03.01. Содержание HIF1a в СА1 поле гиппокампа и втором слое неокортекса…..78

4.01.03.02. Содержание Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа и втором слое неокортекса…81

4.01.04. Анализ активности Г6ФДГ и количества НАДФН……………………………..82

4.01.05. Анализ окислительно-восстановительного статуса и количества общего глутатиона…………………………………………………………………………………84 4.01.06. Определение интенсивности процессов перекисного окисления липидов…...87 4.02. Изучение роли HIF1 в реализации эффектов тяжелой гипоксии в гиппокампе крыс…………………………………………………………………………………….89

4.02.01. Количество TUNEL позитивных клеток в СА1 поле гиппокампа……………..89

4.02.02. Содержание HIF1a, эритропоэтина и Г6ФДГ в СА1 поле гиппокампа………..91

4.02.03. Анализ активности Г6ФДГ и количества НАДФН……………………………..96

4.02.04. Анализ окислительно-восстановительного статуса, количества общего глутатиона и оснований Шиффа………………………………………………………….97 4.03. Использование модели трехкратной умеренной гипобарической гипоксии для анализа роли HIF1 в регуляции транскрипции мРНК Г6ФДГ……………………....99

• Заключение……………………………………………………………………………….101

• Выводы…………………………………………………………………………………...104

• Список сокращений……………………………………………………………………...105

• Список литературы………………………………………………………………………106

5

• ВВЕДЕНИЕ

1.01. Актуальность темы исследования

Нарушение кислородного снабжения мозга рассматривается в настоящее время как

ключевой фактор в развитии множества неврологических заболеваний. Тяжелые формы

гипоксического стресса, такие как ишемический инсульт, представляют собой одну из самых

распространенных причин смерти и снижения качества жизни. Поэтому поиск путей повышения устойчивости мозга к гипоксии/ишемии представляет собой одну из важнейших задач современной биологии и медицины. Основные подходы для решения этой задачи включают не только разработку новых лекарственных средств, но и использование немедикаментозных методов мобилизации эндогенных защитных механизмов (Самойлов и др., 2012). Особого внимания среди таких немедикаментозных методов заслуживает посткондиционирование (ПостК) - предъявление экстремальных воздействий умеренной интенсивности особям, пережившим тяжелое повреждающее воздействие (Zhao et al., 2003).

Настоящее исследование направлено на изучение механизмов нейропротективного действия гипоксического посткондиционирования, а также на расширение представлений

• механизмах метаболических перстроек мозга, лежащих в основе патологических и адаптивных реакций на гипоксию и реоксигенацию. В фокусе нашего внимания была роль гипоксия-индуцируемого фактора-1 (HIF1) в регуляции пентозофосфатного пути (ПФП)

метаболизма глюкозы – основного источника НАДФН в мозге. В связи с тем, что без НАДФН невозможно восстановление таких антиоксидантов как тиоредоксины и глутатион, ПФП представляет собой ключевой регулятор эффективности антиоксидантных систем мозга. Поскольку опосредованная гипоксией гибель нейронов осуществляется с участием активных форм кислорода (АФК), изучение вопроса о возможной взаимосвязи между гипоксией/реоксигенацией в различных режимах, ключевым регулятором клеточного ответа на гипоксию, HIF1, пентозофосфатным путем и опосредованными им функциями является крайне важным как для понимания эндогенных механизмов адаптации мозга, так и для разработки подходов к таргетной терапии постгипоксически