Каппуччинелли - Подвижность живых клеток - 1982 (947289), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Две из ннх наиболее интенсивны: одна соответствует тубулину (который в этих условиях мигрирует в виде субъеднниц с мол. массой около 55000) и другая — высокомолекулярному белку (мол. масса >300000) динеину. Жгутиковый дннеин, впервые очищенный Джнббонсом [56], образует ручки на микротрубочках А периферических дублетов аксонем (см. рис. 3.2). Он обладает аденозинтрифосфатазной активностью. В хвостах сперматозоидов морского ежа (так же, как и в других системах) присутствуют, по-видимому, два изофермента дннеина, которые можно разделить методом дифференциальной солюбилизации в солевых растворах.
Динеин 1 существенно преобладает, и именно из него состоят ручки микротрубочек. Второй изофермент — динеин 2 — содержится в гораздо меньших количествах; он, вероятно, непосредственно не участвует в генерации движения, а играет в этом процессе регуляторную роль. Этот вопрос нуждается, однако, в дальнейшей проверке [57].
Ряд данных указывает на то, что дннеин благодаря своей АТРазной активности играет основную роль в активном скольжении соседних дублетов микротрубочек друг относительно друга, которое делает возможны)и движение жгутика. Опять-таки на материале из хвостов сперматозоидов морского ежа (очень удобный объект, дающий возможность выделять довольно большое количество аксонем) удалось охарактеризовать другой белок, также связанный с микротрубочкамн А.
Это растворимый в кислой среде .полипептид с мол. массой около 165000, который получил название нексия [146], потому что он связывает два соседних (т. е, ближайших, по-английски пех1) дублета. Он, вероятно, ограничивает степень смещения двух соседних дублетов при их скольжении друг относительно друга во время движения жгутика.
Вовсе не просто разобраться в химическом составе и функциональной роли других элементов аксонемы жгутиков. Есть два подхода к решению этой задачи. Можно очистить аксонемы с помощью физико-химических методов, а можно изучать химический состав и ультраструктуру у мутантных организмов с нарушенной активностью жгутиков. Необходимо отметить, что второй подход, хотя он и представляется более разумным и плодотворным, трудно применить в случае сложных организмов, Линку [87] с помощью ряда сложных методов (дифференциальное растворение элементов аксонемы, электронно-микроскопическое наблюдение происходящих структурных изменений, электрофоретическнй анализ химического состава) удалось получить микротрубочки А вместе с прикрепленными к ним дополнительными структурами.
При этом он показал, в частности, что 10 минорных белков наружных дублетов локализовано именно в микротрубочках А. Изучение мутантов Снап?ус(отопаз с парализованными или аномально двигающимися жгутиками позволило соотнести соответствую- 3, Систеиы подвижности эукариотических клеток 3, Системы подвижности эукариотических клеток 53 щие структуры с отдельными белками.
Так, например, сопоставив электрофореграммы аксонем диких штаммов и мутантов, лишенных радиальных спиц, удалось установить, что основной материал спиц — это белок с мол. массой 118000 Изучение мутантов без центральных микротрубочек н без окружающей их оболочки позволило идентифицировать три полипептида с мол. массами более 220000; эти белки образуют оболочку 1177]. Вполне вероятно, однако, что состав аксонемы сложнее, чем получается по данным описанных выше методов, так как разрешающая способность электрофореза могла быть недостаточна. Действительно, применив двумерную изоэлектрофокусировку в сочетании с гельэлектрофорезом в додецилсульфате натрия, в составе аксонемы диких штаммов СЫатус/отопаз удалось выявить по крайней мере 100 полицептидов.
С помощью того же метода исследовали мутантов с аксонемой без радиальных спиц и обнаружили, что у таких организмов не хватает 12 белков 1116]. Эти результаты показывают, как сложна эта система белков и как много надо сделать для выяснения ее состава. С другой стороны, оказалось приятной неожиданностью, что система белков, связанных с цитоплазматическими микротрубочками, как сейчас представляется, не так сложна, как в жгутиках.
Возможно, однако, что меньшая сложность белков, связанных с микротрубочкамн, свойственна именно клеткам нервной системы, которые пока что были практически единственным объектом такого рода исследований. Современные представления о свойствах тубулина основываются на данных о тубулине из мозговой ткани, который исследован лучше всего, так как был найден простой метод его получения в довольно больших количествах из мозга млекопитающих 1экстракты которого содержат более 20'/, тубулина от общего количества белка) с помощью многократно повторяемых циклов полимеризации — деполимеризации микротрубочек при изменении температуры 1133, 174].
При получении тубулина методом полнмеризации — деполимеризации микротрубочек другие белки также подвергаются очистке и выделяются вместе с тубулином в стехиометрических соотношениях. Было показано, что эти сопутствующие белки 1сокращенно их называют БСМ вЂ” белки, связанные с микротрубочками) связаны не только с интактными микротрубочками в клетках центральной нервной системы, но и с цитоплазматическими микротрубочками и микротрубочками митотического веретена клеток других типов. Хотя в разных лабораториях условия очистки не совсем одинаковы и есть существенные различия между выделяемыми препаратами белков, связанных с микротрубочками, удается достаточно надежно идентифицировать и охарактеризовать две группы БСМ 1см.
табл. 3,1). Наиболее обширную из них составляют высокомолекулярные белки, подвижность которых при электрофорезе в полиакрнламидном геле соответствует мол. массе около 300000 124]. На эти белки в некоторых препаратах микротрубочек приходится около 20е/е от содержания тубулина. По данным электронной микроскопии высокомолекулярные БСМ образуют тонкие выступы, равномерно распределенные вдоль микротрубочек 1101]. По высокой молекулярной массе этих белков и их способности образовывать боковые ручки их можно было бы считать похожими на дннеин.
Однако в отличие, от последнего в них не обнаружена АТРазная активность и нет указаний на то, что они участвуют в движении микротрубочек. Другая группа БСМ вЂ” белки с мол. массой около 70000. В некоторых лабораториях получены препараты тубулнна, в которых этим белкам соответствует одна полоса при электрофорезе и они названы тау-белком 1173]. Показано, что флуоресцирующие антитела против тау-белка локализуются в цитоплазматических микротрубочках; этот белок способствует, по-видимому, их сборке. Стимулируемая циклическим АМР протеинкиназа, ответственная, по-видимому, за посттрансляционное фосфорилирование тубулина, также может быть отнесена к БСМ, поскольку показано, что она связывается с тубулином в определенных стехиометрических соотношениях, которые не изменяются в течение нескольких циклов очистки путем полимеризации — деполимеризации мнкротрубочек ]140]. 54 3.
Системы подвижности эукариотичсских клеток 3. Системы подвижности эчкариотнчсских клеток 55 3.3. Самосборка микротрубочек и ее регуляция В любой живой клетке происходит агрегация тубу- лина с образованием микротрубочек и распад этих структур, Вопрос о том, как регулируются процессы сборки и деструкции микротрубочек имеет первостепенное значение для понимания многих проявлений жизнедеятельности клетки.
3.3.1. Самосборка (и чйго Изучение !и чйго полимеризации тубулина, выделенного из нервных клеток, оказалось ценным источником информации для понимании механизма сборки микро- трубочек ш чгчо и путей управления этим процессом. В этом разделе мы прежде всего рассмотрим сборку микротрубочек )и чйго и затем обсудим, что может происходить в живой клетке. Если нейротубулин находится в растворе в виде димеров в присутствии связанных с ним белков, то в определенных условиях легко идет процесс самосборки.
Полимеризация происходит в условиях умеренной ионной силы, при слабо кислом рН (около 6,6 — 6,7), в присутствии нуклеотидов (ОТР) и ионов магния. Направление реакции зависит также от температуры; 1и чНго при физиологических температурах идет полимеризация тубулина с образованием микротрубочек, а снижение температуры до О'С вызывает их быструю деполимеризацию (рис. 3.6). Реакцию полимеризации можно ре- Рис. 3.6. Реакция полимсризации димероз тубулина с образованием микротрубочск.
Указано влияние двухвалеитиых ионов и температуры. гистрировать спектрофотометрически — по изменению светорассеяния — или же с помощью вискозиметра — по изменению вязкости раствора. Образование микротрубочек можно наблюдать также в электронный микроскоп (53, 142). Ясно, что в такой простой системе !и чйго легко можно порознь оценить эффект различных параметров, влияющих на реакцию полимеризации. В частности, было установлено, что полимеризации способствуют высокие концентрации сахаровы или глицерина, тогда как полианионы (РНК, алкалоиды типа колхицина) угнетают полимеризацию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
