Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента.

Главным признаком, используемым при отношении протеолитических ферментов к тому или иному классу, является строение каталитического центра.

Отправной точкой в изучении строения активного центра, механизма катализа является идентификация функциональных групп, что достигается комплексными исследованиями и, в первую очередь, применением специфических ингибиторов. В наших опытах в качестве ингибиторов были использованы ЭДТА, монойодуксусная кислота, n-хлормеркурийбензоат натрия, фенилметилсульфатонилфторид, диизопропилфторфосфат, перманганат калия.

Растворы ферментов, содержащие 510^-3М этих соединений, выдерживали при 30^оС в течение одного часа.

Как показали результаты опытов, протеиназа 1 полностью инактивировалась ЭДТА – ингибитором металлоферментов, остальные ферменты не изменяли протеолитическую активность.

Протеиназа 2 инактивировалась монойодуксусной кислотой и n-хлормеркурийбензоатом натрия на 84 и 63% соответственно. Фермент терял активность при воздействии фенилметилсульфатонилфторидом и диизопропилфторфосфатом, это даёт возможность предположить, что протеиназа 2 относится к «сериновым». Не оказывал влияния не на одну из протеиназ перманганат калия, что свидетельствует об отсутствии в активном центре карбоксильной группы.

На основе полученных данных можно предположить, что протеиназа 1 относится к «металлоферментам», а протеиназа 2 – к «сериновым».

В дальнейшем было интересно рассмотреть влияние на протеиназы гистидина. На протеиназу 2 он не оказывал ингибирующего действия, в то время как полностью ингибировал протеолитическую и коллагеназную активности протеиназы 1. Из литературы известно, что гистидин является ингибитором коллагеназ. В связи с чем очевидно, что протеиназа 1 является ферментом, проявляющим свойства протеиназы с коллагеназным действием..

К специфическим реагентам относятся также ионы металлов. Они могут оказывать ингибирующий или активирующий эффект. В наших опытах мы использовали соли двухвалентных металлов в виде хлоридов и концентрации 0,005М. Фермент выдерживали в соли, а затем определяли остаточную активность. Ионы Mn²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺ практически не оказывали никакого влияния на активность обеих протеиназ; Zn²⁺, Co²⁺ незначительно ингибировали оба фермента, ионы Cd²⁺, Cu²⁺ ингибировали протеиназу 1, а протеиназа 2 ингибировалась ионами Fe²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ . Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Влияние ионов металлов на активность протеиназ Penicillium wortmannii 2091.

3.7 Субстратная специфичность.

В изучении протеолитических ферментов значительное место занимают исследования специфичности их действия. В литературе нет сведений, касающихся вопроса специфичности действия протеиназ грибов рода Penicillium. В связи с этим исследовалась способность протеиназы 1 к гидролизу некоторых пептидных связей.

Исследования проводили на синтетических пептидах и различных белках. Результаты показали, что протеиназа 1 гидролизовала довольно широкий спектр пептидных связей. Она разрывала связи в пептидах: цис – ала, про – ала, гли – лей, гли – мет, ала – гли – гли, ала – гли – фен. Следует отметить, что гидролизу подвергались связи, характерные для белков животного происхождения. В связи с этим мы исследовали специфичность действия протеиназы на животных белках. В качестве субстратов использовались: казеин, гемоглобиин, денатурированный мочевиной, кератин, коллаген, желатина. При одной и той же концентрации фермента наиболее активно расщепляется казеин (78 – 80%) и гемоглобин (60 – 62%), затем слабее желатина и коллаген. Менее всего гидролизу подвергается кератин (22 – 25%) (рис.5).

3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья: ноги птиц, шквара.

Мясная промышленность располагает значительным количеством шквары, получаемой при перетопке говяжьего и свиного жиросырья. Анализ химического состава шквары свидетельствует о значительном содержании в ней белковых веществ и подтверждает целесообразность её использования как в колбасном, так и ряде других производств. Общее содержание белка в шкваре колеблется в пределах 65 – 80%. В состав белков входят 22 – 44% коллагена и 19 – 30% эластина. Однако использование шквары ограничивалось из-за большого содержания соединительной ткани. В настоящее время соединительную ткань рассматривают не как билластное вещество, а как необходимый компонент питания [10]. В связи с этим возрастает практический интерес к рациональному и полному использованию шквары на пищевые цели, разработке путей повышения её биологической ценности. Это направление явилось основой разрабатываемой нами темы.

Для получения гидролиза шквары целесообразно использование протеиназ, расщепляющих белки в нейтральной зоне рН и действующих на коллаген.

степень

гидролиза , %

, час

Рис. 5. Динамика гидролиза различных белков препаратом

протеиназ Pen. wortmannii 2091:

1 – казеин; 2 – гемоглобин; 3 – желатина;

4 – коллаген; 5 – кератин.

1

2

3

4

5

Нами был проведён сравнительный анализ промышленных препаратов, обладающих этими свойствами и полученного препарата (табл. 5).

Таблица 5.

Характеристика протеолитических свойств и степени гидролиза гомогената шквары под действием различных ферментных препаратов.

Контролем служила среда, где вместо фермента была добавлена дистилированная вода в аликвотном количестве.

Согласно полученным результатам,препарат протовортманин наиболее эффективен при получении белкового гидролизата.

В дальнейшем нами были определены условия эффективной работы фермента. Наши исследования ограничивались изучением влияния гидромодуля среды, температуры, продолжительности гидролиза, дозировки препарата, т. е. параметров, играющих решающее значение для разрабатываемой технологии и влияющих на экономику процесса.

Протеолитические ферменты катализируют реакцию расщепления белков с участием воды. В связи с этим важным моментом в подборе условий гидролиза является определение минимального гидромодуля для высокого гидролиза субстрата.

Постановка эксперимента заключалась в следующем: в семь колб объёмом в 100см³ вносили по 10 г гомогената шквары, затем одновременно раствор ферментного препарата и соответствующий объём воды. После внесения фермента и воды колбы закрывали и ставили на 3 часа в ультратермостат при 50^оС. Результаты эксперимента оценивали по степени накопления аминного азота (рис.6). Как видно на рисунке 6 для активного гидролиза белков сырья достаточен гидромодуль гомогенат / вода = 1/1 : 1,5. Дальнейший рост содержания воды в среде увеличения степени гидролиза не даёт.

Решающее значение в ферментативных реакциях имеет температура: при низких температурах фермент может быть практически не активен, а высокие температуры могут привести к инактивации фермента. Поэтому при постановке этого эксперимента особое внимание уделялось поддержанию строгого температурного режима. Эксперимент проводился в трёх поверхностях. В 15 колб по 100см³ вносили 10 г гомогената. Колбы помещали в термостаты при температурах 20, 30, 40, 50, 60^оС. Затем вносили по 3см³ фермента и 12см³ воды (согласно ранее полученным данным), плотно закрывали и вели гидролиз в течение 3 часов. По истечению 3 часов из каждой колбы отбирали по 10см³ субстрата и определяли аминный азот по методике Серенсена. Результаты представлены на рис. 7. Как видно на рис.7 наибольшее накопление аминного азота, а, следовательно, и максимальная степень гидролиза наблюдается при температуре 50^оС. При температурах 20, 30, 40^оС гидролиз, видимо, идёт не до конца, т. е. эти температуры не обеспечивают достаточной катализирующей способности ферментного препарата и требуют увеличения продолжительности процесса гидролиза, что с точки зрения технологического процесса очень невыгодно.

Температура 60^оС приводит, по-видимому, к частичной инактивации фермента. Дальнейшее увеличение температуры приведёт, скорее всего к полной инактивации фермента, поэтому исследование действия ферментного препарата при температурах выше 60^оС не имеет смысла.

Таким образом, оптимальная температура гидролиза субстрата препаратом из Penicillium wortmannii 2091 равна 50^оС.

Аминный азот,

мг

Рис. 6. Зависимость накопления аминного азота от

соотношения гомогенат-вода.

Гидромодуль

Аминный азот,

мг

Рис. 7. Зависимость накопления аминного азота от

температуры в процессе гидролиза.

t, ^оС

Дальнейшим этапом нашей работы было определение дозировки препарата. Дозировка препарата в большей степени отражается на экономической стороне процесса, так как ферментные препараты пока ещё имеют достаточно высокую стоимость. Эксперимент проводился по аналогии с предыдущим с учётом оптимальной температуры и внесением различного количества ферментного препарата. Фермент вносили (по ПА) в количестве 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0 ед. (в расчёте на 10 г гомогената). После трёх часов гидролиза определяли аминный азот. Результаты представлены на рис.8.

Исходя из полученных в ходе эксперимента данных можно сделать вывод о целесообразности внесения 4,0 ед. (по ПА) ферментного препарата в расчёте на 10 г белкового сырья.

Время гидролиза, необходимое для течения реакции, отражается на продолжительности всего технологического процесса. Именно с целью определения минимального времени гидролиза с максимальным эффектом накопления аминного азота был поставлен следующий эксперимент: гомогенат в количестве 40 г, с выбранным гидромодулем, помещали в термостат при 50^оС и добавляли раствор фермента в оптимальном количестве. Пробы отбирали каждый час с момента внесения фермента. Эксперимент проводился в трёх повторностях.

Характеристики

Список файлов реферата