Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Сложность и трудоёмкость приготовления препаратов ферментов, потеря значительной доли коллагена в результате неполной его экстракции и денатурации под влиянием повышенной температуры, действующей длительное время, снижают значение методов обработки коллагена протеолитическими ферментами животного и растительного происхождения. Новые перспективы и реальная возможность внедрения биотехнологических методов в производство возникает при использовании микробных ферментных препаратов, отличающихся высокой стабильностью, возможностью варьировать специфику биохимических свойств. Было проведено изучение эффективности ферментативного гидролиза балластных компонентов различных коллагенсодержащих источников с применением ряда микробных препаратов: протосубтилина, протомегетерина, липоризина, выделенных из соответствующих микроорганизмов (B. subtilis, B. megaterium, R. oryzae).

Таким образом, для мясной промышленности наибольшую перспективу имеют микробные ферментные препараты и клетки, характерные специфической активностью в отношении фибриллярных белков упроченной структуры.

Оценка эффективности биотехнологий переработки коллагенсодержащего сырья предполагает экономию 10 – 20% основного сырья при получении полноценных мясных продуктов и 70 – 100% - в случае выработки искусственных оболочек и плёнок.

Применение специфических ферментных препаратов и клеток позволяет осуществить принципиально новые технологии глубокой и комплексной переработки основного, вторичного сырья и не пищевых отходов с реализацией режимов в естественных диапазонах температуры, рН среды и давления, минимальными энергозатратами, без дополнительных капитальных вложений и нежелательных экологических воздействий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Определение величины рН.

Величину рН определяли потенциометрически на рН-метре ЛПУ-01. Для измерений значений рН растворов в температуре отличной от 20^oС, применяли автоматическую компенсацию.

2.2 Метод определения протеолитической активности.

Протеолитическую активность (ПА) определяли по ГОСТ 20264.2-74 [12]. Субстратом служил 2% раствор казеината натрия, к которому добавляли 2см³ раствора фермента и помещали в ультратермостат при температуре 30^oС. После проведения гидролиза в течение 10 минут в опытную пробирку приливали 4см³ раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживали ещё 20 минут при температуре 30^oС. Затем фильтровали в сухие пробирки. К 1см³ фильтрата добавляли 5см³ 0,5М раствора карбоната натрия, перемешивали и добавляли 1см³ рабочего раствора Фолина. Через 30 минут измеряли оптическую плотность раствора на ФЭКе КФК-2 при 670 нм в кюветах с поглощающим свет слоем 10 мм против контроля. За единицу ПА принимают такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30^oС катализировало переход в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 ммолю тирозина (1ммоль тирозина равен 0,181мг).

2.3 Определение коллагеназной активности.

Коллагеназную активность определяли по содержанию оксипролина в смеси, образовавшегося в результате действия фермента на нативный коллаген. С этой целью готовили реактив для окисления: 28,2 г хлорамина Т растворяли в 40см³ воды для получения 0,05М концентрации, добавляли 60см³ ацитат-цитратного буфера с рН 6,0. К 2см³ анализируемой пробы, содержащей 2 - 20 см³ оксипролина, приливали 1мл реактива для окисления, встряхивали и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Затем в смесь вносили 2 – 1 см³ 4М хлорной кислоты, встряхивали и через 5 минут приливали 3см³ 10% раствора n-диметиламинобензальдегида в метилцеллосольфе. Пробу нагревали 15 минут в водяной бане при 150^оС и после охлаждения фотометрировали с зелёным светофильтром на ФЭК-56М (555нм).

Гидролиз коллагена вели в следующих условиях: 20 мг нативного коллагена обрабатывали исследуемым ферментным препаратом в присутствии буферной системы с рН 7,0 так, чтобы общий объём составил 25см³. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37^oС. Контролем служили пробы, инкубированные в тех же условиях, но без фермента, предварительно остановив реакцию внесением 0,5см³ этанола и центрифугированием смеси в течение 15 минут при 6000 чмин^-1.

Активность коллагеназы выражали либо в ммолях оксипролина на 1 мг белка за 60 минут, либо в процентах растворения.

2.4 Определение молекулярной массы фермента.

Молекулярную массу определяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе У-100. Расчёт проводили по формуле:

LgM=5,941-0,847 (V/V₀),

где V – объём выхода фермента;

V₀ – свободный объём колонки.

2.5 Определение содержания аминного азота.

Метод основан на образовании цветного комплекса при взаимодействии аминогрупп аминокислот с гидроксидом меди. В пробирку, содержащую 100 мг сухого медного реактива, вносили 4см³ анализируемой пробы, предварительно нейтрализованной сухим бикарбонатом натрия, выдерживали 15 минут периодически встряхивая. Затем центрифугировали и измеряли оптическую плотность на ФЗКе КФК-2 при 590 нм. В контроле вместо 4см³ пробы присутствовало 4см³ дистилированной воды. Содержание аминного азота рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для известных аминокислот.

2.6 Электрофоретические исследования.

2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов.

Электрофорез проводили по методу Дэвиса на приборе фирмы Reanol (Венгрия) в щелочной буферной системе, рН 8,9. Концентрация акриламина в мелкопористом геле составила 5%. Длина мелкопористого геля в трубочке составила 5,5 см. Растворы для полимеризации готовили обычным способом. Исследуемый образец, содержащий 20 – 30 мкг белка смешивали в соотношении 1 : 1 с 40% раствором сахарозы и наносили на трубочку с гелем. Объём образца не превышал 0,2 см³. Поверх образца осторожно наслаивали электродный буфер, который содержал в 1 л 0,6 г трис-(гидроксиметил)-амино-метана и 2,88 г глицина.

В верхний резервуар прибора вносили 1 см³ 0,001% раствора бромфенолсинего для контроля за движением фронта подвижных ионов. В первые 10 – 15 минут сила тока составила 1мА на трубочку, а затем 2,5мА. После окончания электрофоретического разделения гели вынимали из трубочек и проводили окрашивание. Окрашивание проводили раствором амидочерного с массовой долей 0,5, приготовленного с массовой долей 7 уксусной кислоты. Окрашивание проводили 20 – 30 минут. Краситель отмывали с массовой долей 7 уксусной кислотой с многократной сменой раствора.

2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ [16].

Для проявления в гелях полос с протеиназой их выдерживали в денатурированном растворе гемоглобина 2% концентрации в течение 15 – 30 минут при температуре 30^oС. Затем промывали несколько раз дистиллированной водой и переносили в раствор амидочерного. Проводили окрашивание в течение 20 – 30 минут. Краситель отмывали 7% уксусной кислотой. Если в гелях присутствовала протеиназа, то появлялись белые полосы.

Все опыты, описанные в работе, проводили 3 –4 раза, аналитические определения для каждой пробы проводили в двух – трёх повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из двух или трех определений. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕИНАЗЫ

PENICILLIUM WORTMANNII 2091 И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

Известно, что микроорганизмы синтезируют богатые набором ферментов комплексы. Поэтому важным этапом в получении препаратов направленного действия является изучение условий их выделения, очистки от сопутствующих биологически активных и баластных веществ. В связи с малой изученностью представителей грибов Penicillium этот этап представляет особую важность.

3.1 Разработка условий выделения препарата

Penicillium wortmannii BKMF 2091.

Для выделения ферментов из различных сред в лабораторных условиях и в промышленности чаще всего применяют органические растворители и нейтральные соли.

Эффект осаждения белков органическими растворителями, как известно [7], основан на явлении уменьшения сольватации полярных групп фермента. Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение белковых молекул.

В качестве осадителей использовали 96,5% этанол, 98,0% изопропанол, химически чистый ацетон и сульфат аммония. Органические растворители и сульфат аммония добавляли к охлажденной до 0 – 4^oС культуральной жидкости Pen. Wortmannii 2091 при различных значениях рН и постоянном перемешивании. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, растворяли в небольшом объёме дистиллированной воды и определяли протеолитическую активность.

Результаты исследования влияния рН на полноту осаждения протеолитического комплекса при концентрации растворителей 60% представлены на рис. 1, из которого видно, что оптимальным является значение рН 7,5 при использовании всех видов органических растворителей. Вероятно, изоэлектрическая точка для данного фермента лежит в этой области рН.

В дальнейшем нами проводились исследования по влиянию концентрации органических растворителей на выход фермента при оптимальном значении рН. Наблюдалось монотонное осаждение фермента при последовательном увеличении концентраций осадителей, выход фермента возрастал до определённого предела (табл. 1).

Как видно из табл. 1, концентрация органических растворителей значительно влияет как на выход протеолитического комплекса, так и на степень его очистки. При использовании этанола наиболее эффективной для выхода ПА была концентрация 72,0%. Степень очистки 1,27. Максимальный выход 98,5% по активности.

Оптимальная концентрация ацетона 66,6% (в объёмных соотношениях 1: 2). Степень очистки была более высокой, чем для этанола (1,5 раза) – однако выход по активности всего 62%. Лучшим органическим осадителем для протеиназы Pen. Wortmannii 2091 явился изопропанол. При концентрации его в смеси 50% выход протеиназы составил 90, 5%, степень очистки 2,78 и удельная активность 3,06.

Таким образом, изопропанол избирательно осаждает протеолитические ферменты, что повышает степень их очистки и снижает содержание баластных примесей. Однако на практике вполне можно использовать и этанол.

В дальнейшем проведены исследования по осаждению протеиназы сульфатом аммония. Было установлено, что при оптимальных условиях (степень насыщения 0,8 рН 7,5) выход фермента составил всего 23%. Низкий вы-

ПА , %

Рис. 1. Влияние величины рН на осаждение протеолитического

комплекса различными растворителями:

ось абсцисс – величина рН;

ось ординат – выход по активности в %;

1 – этанол; 2 – изопропанол; 3 – ацетон.

3

Т

1

2

аблица 1

Получение препарата протеиназы из культуральной жидкости Penicillium wortmannii 2091

осаждением органическими растворителями.

Содержание осадителя		Общая активность, ед	Белок, мг/см3	Общий белок, мг	Вес препаратов, мг	Удельная активность, ед/мг белка	Выход по активности, %	Очистка
В объёмных отношениях	В %
Ацетон
Культуральная жидкость рН 7,5
-	-	2,5	2,250	62,5	-	1,10	100,0	1,00
1:1	50	179,0	0,180	21,6	120	0,99	17,4	0,90
1:2	66,6	222,0	0,133	46,4	349	1,67	62,0	1,50
1:3	75,0	213,0	0,233	51,9	223	0,91	38,0	0,82
1:4	80,0	203,0	0,216	64,6	299	0,94	49,0	0,85
Изопропанол
Культуральная жидкость рН 7,5
-	-	2,5	2,250	62,5	-	1,10	100,0	1,00
1:1	50,0	392,0	0,128	36,9	288	3,06	90,5	2,78
1:2	66,6	385,4	0,232	67,4	290	1,65	92,0	1,50
1:3	75,0	215,0	0,282	211,5	350	0,76	60,0	0,69
1:4	80,0	183,0	0,132	42,2	320	1,39	46,0	1,26
Этанол
Культуральная жидкость рН 7,5
-	-	2,5	2,250	62,5	-	1,10	100,0	1,00
1:1	48,0	320,3	0,396	85,1	215	0,80	55,0	0,73
1:2	64,0	366,7	0,340	90,1	265	1,08	77,6	0,98
1:3	72,0	385,4	0,276	135,2	320	1,40	98,5	1,27
1:4	80,0	349,6	0,250	160,0	335	1,40	93,7	1,27

ход фермента не позволил в дальнейшем использовать эту соль для получения препарата Pen. Wortmannii BKMF 2091.

Характеристики

Список файлов реферата